靶向性抗腫瘤藥物EGF-E4orf4的研究.pdf

1、腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康與生命的疾病。近年來(lái)盡管抗腫瘤藥物已經(jīng)有了很大的發(fā)展，但仍存在著針對(duì)性差，殺傷正常細(xì)胞的毒副作用。因此研制能夠靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的基因工程藥物有重大的理論和實(shí)踐意義。 本組前期工作中利用EGF與EGFR結(jié)合的靶向性及腺病毒E4orf4蛋白的細(xì)胞毒性，通過(guò)基因重組及酵母表達(dá)技術(shù)，已設(shè)計(jì)并表達(dá)了一種新的融合蛋白EGF—E4orf4。前期工作表明，該融合蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA—MB—231，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤

2、細(xì)胞BT325和人骨肉瘤細(xì)胞Saos—2都有抑制作用，但尚存在重組蛋白EGF—E4orf4表達(dá)量偏低，純化效率不高等問(wèn)題。本論文在此基礎(chǔ)上，對(duì)融合蛋白EGF—E4orf4的表達(dá)，純化和功能三個(gè)方面進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。 本論文的第一部分工作是提高融合蛋白的表達(dá)量和純度。利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵表達(dá)，與搖瓶相比較，提高了融合蛋白的表達(dá)量。優(yōu)化純化流程，通過(guò)超濾結(jié)合離子交換和凝膠過(guò)濾兩步柱層析純化，提高了目的蛋白的純度。經(jīng)鑒定，重

3、組融合蛋白EGF—E4orf4是以蛋白聚合體形式存在，為進(jìn)一步提高純化效率帶來(lái)了困難。為此，對(duì)該蛋白進(jìn)行了改造：(1)在融合蛋白的羧基端添加(His)6標(biāo)簽，以便于提高純化效率。(2)以可以與EGFR結(jié)合的環(huán)七肽替代融合蛋白中的EGF，構(gòu)建環(huán)七肽—E4orf4—His融合蛋白，減少二硫鍵的數(shù)目，并且可以排除E4orf4蛋白的細(xì)胞毒性作用受到EGF的促生長(zhǎng)作用干擾的可能性。通過(guò)親和層析和凝膠過(guò)濾層析，對(duì)上述兩種蛋白進(jìn)行純化，得到純度較高的

4、目的蛋白。 本論文的第二部分工作是進(jìn)一步研究融合蛋白EGF—E4orf4的生物學(xué)功能。主要以人乳腺癌細(xì)胞MDA—MB—231和人胃癌細(xì)胞BGC823為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。通過(guò)Western blotting檢測(cè)EGFR磷酸化程度，發(fā)現(xiàn)融合蛋白EGF—E4orf4可以誘導(dǎo)EGFR發(fā)生磷酸化，并且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的融合蛋白和EGF孵育不同時(shí)間后的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：FITC—EGF進(jìn)入細(xì)胞后信號(hào)逐漸減弱，并且與

5、溶酶體共定位；而FITC—EGF—E4orf4則隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)累積增強(qiáng)，并且在24h不與溶酶體共定位。融合蛋白EGF—E4orf4的抗腫瘤作用則表現(xiàn)在抑制BGC823細(xì)胞的克隆形成能力以及抑制MDA—MB—231和BGC823細(xì)胞的裸鼠移植腫瘤的生長(zhǎng)，最大抑瘤率分別為79％和49％(P<0.05)。在急毒實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)EGF—E4orf4蛋白對(duì)裸鼠有任何毒副作用。 最后一部分工作是構(gòu)建了四環(huán)素可誘導(dǎo)表達(dá)E4orf4

6、蛋白的真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，并通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證明誘導(dǎo)表達(dá)E4orf4蛋白可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。以未誘導(dǎo)細(xì)胞為對(duì)照，對(duì)四環(huán)素誘導(dǎo)E4orf4蛋白表達(dá)6h和60h的細(xì)胞進(jìn)行全基因組芯片掃描，作了初步分析，為今后研究E4orf4蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 綜合上述研究結(jié)果表明，融合蛋白EGF—E4orf4確實(shí)可以通過(guò)EGFR這個(gè)分子靶點(diǎn)的介導(dǎo)，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，融合蛋白EGF—E4orf4可以特異地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并具有