骨髓間質(zhì)干細胞治療難治性慢性移植抗宿主病的臨床研究.pdf

1、研究背景
　　 慢性移植物抗宿主?。–hronic graft versus host disease，cGVHD）是異基因造血干細胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后長期存活患者的主要并發(fā)癥，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，是非復發(fā)死亡的主要原因。隨著allo-HSCT的廣泛開展，約40％～70％患者可發(fā)生不同程度的cGVHD，廣泛型cGV

2、HD病死率高達50％，嚴重限制了allo-HSCT的應用和發(fā)展。有關(guān)cGVHD的發(fā)病機制迄今尚未清楚，多數(shù)學者認為主要是由于供者自身反應性T細胞的活化所引發(fā)的自身免疫反應。T細胞活化是個多信號、多步驟的復雜過程，傳統(tǒng)免疫抑制劑僅能通過阻斷其中的一個環(huán)節(jié)，無法高效特異地阻斷T細胞的活化。另外，現(xiàn)行免疫抑制劑的靶點在多種器官組織普遍表達，長期聯(lián)合多種免疫抑制劑造成一系列毒副作用，嚴重影響患者的生活和生存質(zhì)量?；谏鲜霈F(xiàn)狀，移植領域亟待探索新

3、的治療途徑來進一步提高cGVHD療效，提高移植后患者的生活質(zhì)量和延長生存期。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有高度自我增殖能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用的組織干細胞。在促進骨髓移植后的造血重建、組織修復、基因治療等方面有著廣泛的應用前景;因其具有低免疫原性和免疫負調(diào)節(jié)作用，在移植免疫耐受的作用越來越被關(guān)注。MSCs可以通過分泌可溶性因子（如生長因子、細胞因子、趨化因子、

4、蛋白酶）和細胞間直接接觸等方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs可調(diào)節(jié)包括樹突狀細胞、NK細胞、T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞和B淋巴細胞等多種免疫細胞，而正是這些細胞觸發(fā)了cGVHD導致受者組織器官損傷的病理生理過程，因此，MSCs具有防治cGVHD的巨大潛能。
　　 越來越多的臨床研究證實，靜脈輸注體外擴增MSCs能安全有效地預防和治療aGVHD。我們于2004年開始應用體外擴增、不同供者來源的MSCs治療激素耐藥的重度aGVHD，有效降

5、低了重度腸道aGVHD的死亡率。但對于MSCs治療cGVHD的作用罕見報道，基于MSCs治療aGVHD獲得成功，而cGVHD的危險因素與aGVHD相近，以及MSCs在自身免疫性疾病動物模型上獲得良好的治療效果，我們提出開展觀察MSCs治療難治療cGVHD的安全性及療效的臨床研究，并探索MSCc抗cGVHD的可能機制，以期為cGVHD的新治療策略提供臨床及實驗依據(jù)。
　　 為此本研究首先通過回顧性分析191例行allo-HSCT患

6、者臨床資料進行回顧性分析，以期深入了解cGVHD臨床特征、相關(guān)危險因素以及難治性cGVHD的發(fā)病情況;其次，通過體外擴增、培養(yǎng)志愿者骨髓獲得臨床應用級MSCs;最后，應用體外擴增MSCs治療難治性cGVHD患者，探討MSCs治療難治性cGVHD的安全性和臨床療效，并對其抗cGVHD的可能機制進行初步探索。本論文共分為三部分:
　　 第一部分：慢性移植物抗宿主病臨床特征總結(jié)與相關(guān)因素分析
　　 1.方法：
　　 本

7、研究通過回顧性分析廣東省人民醫(yī)院血液科2004年6月15日至2011年9月15日期間進行allo-HSCT的191例患者，分析cGVHD的發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、治療效果、發(fā)病的危險因素及其對生存的影響，為臨床有效防治cGVHD提供指導依據(jù)。
　　 2.結(jié)果：
　　 2.1.GVHD累積GVHD發(fā)生率為72.8％(139例)，其中aGVHD發(fā)生率為42.4％（81例），中位發(fā)生時間為33.0(12.0～129.0)天，Ⅱ-Ⅳ

8、度aGVHD占23.6％，Ⅲ-Ⅳ度aGVHD占13.1％。
　　 2.2.cGVHD累積發(fā)生率為56.0％(107例)，中位發(fā)生時間為147.0(65.0～1060.0)天;原發(fā)型58例(30.4％)，靜止型13例(6.8％)，進展型36例(18.8％);根據(jù)NIH綜合分度:輕度cGVHD16例，中度59例，重度32例;傳統(tǒng)cGVHD分度:局限型23例，廣泛型84例。
　　 2.3.cGVHD最常見累及口腔(72％)、眼

9、(70.1％)、皮膚(65.4％)和肝臟(58.9％)，其次是胃腸道(23.4％)、造血系統(tǒng)(19.6％)、肺(15.0％)、肌肉關(guān)節(jié)(5.6％)和腎臟(4.7％)。
　　 2.4.107例患者中，非難治組58例(54.2％):18例不需抗cGVHD治療（輕度14例、2例伴中度血小板減少、2例中度存在殘留?。?另外40例需抗cGVHD治療:系統(tǒng)免疫中位治療時間為11.150(3.0～37.50)個月，成功停藥的25例中位治療時間

10、為12.40(3.0～37.50)個月，未能停藥的15例中位治療時間為9.80(5.90～22.20)個月。經(jīng)激素±CSA治療后無效或減量過程中進展49例(45.8％)，診斷為難治性cGVHD，加用二線治療(FK506/MMF/MTX/反應停/青霉胺等)，中位治療時間為25.90(5.7～86.7)個月，12例(24.5％)患者可撤停免疫抑制治療，中位免疫抑制劑時間26.55(15.2～38.6)個月;37例(73.5％)病例仍在治療中

11、，IM中位治療時間25.90(5.7～86.7)個月。
　　 2.5.單因素回歸分析提示供者來源、HLA配型不合、女供男移植、回輸CD34+細胞數(shù)、aGVHD、晚期感染與cGVHD的發(fā)生密切相關(guān)，而ATG的使用降低cGVHD的發(fā)生;多因素分析顯示疾病移植后反復感染以及眼、血液系統(tǒng)受累等因素是難治cGVHD的危險因素。
　　 2.6.cGVHD組與非cGVHD組5年預期OS及DFS分別為71.0±4.7％vs47.5±5.

12、9％及68.6±4.9％vs44.7±6.0％(p＜0.01);輕、中度cGVHD患者的OS及DFS優(yōu)于非cGVHD組及難治組(OS:87.5％和79.7％vs51.2％和56.3％，DFS:81.3％和76.3％vs48.8％和56.3％)(P＜0.05)。
　　 2.7.難治組49例患者中，11例死亡患者中，9例為cGVHD相關(guān)死亡，占總cGVHD相關(guān)死亡率60％，高于非難治組cGVHD。
　　 3.結(jié)論:
　

13、　 3.1.本研究中191例患者接受Allo-HSCT，cGVHD發(fā)生率為56％，但cGVHD相關(guān)死亡為7.853％，低于文獻報道。
　　 3.2.cGVHD患者5年生存優(yōu)于非cGVHD患者，輕中度cGVHD更有優(yōu)勢。
　　 3.3.患者年齡、女供男移植、aGVHD及移植晚期感染是cGVHD的危險因素(P＜0.05)，ATG應用是cGVHD的保護因素。
　　 3.4.難治cGVHD發(fā)生率為45.8％，cGVHD

14、相關(guān)死亡占60％，是Allo-HSCT非復發(fā)死亡的主要原因。移植后反復感染及眼、血液系統(tǒng)受累等因素預示cGVHD為難治性(P＜0.05)。
　　 第二部分：臨床應用級人骨髓間充質(zhì)干細胞的體外擴增
　　 1.方法:
　　 無菌抽取健康成年志愿者骨髓20ml～40ml，F(xiàn)icoll-Hypaque密度離心法分離，種于含10％胎牛血清低糖培養(yǎng)基中，借助MSCs的貼壁特性，反復換液、棄懸浮細胞，逐步獲得較純的MSCs。通

15、過形態(tài)學觀察;流式細胞術(shù)分析細胞表型;向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細胞為MSCs。從培養(yǎng)第三天起，每傳一代均留取培養(yǎng)上清做細菌、真菌、病毒、支原體的檢測，細胞輸注前24小時培養(yǎng)液更換為未添加血清的低糖培養(yǎng)液。成瘤性實驗觀察細胞在體內(nèi)是否具有致瘤性，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞生長狀態(tài)，適時適量添加堿性成纖維細胞生長因子，以快速有效地擴增至臨床治療所需要的細胞量。
　　 2.結(jié)果:
　　 2

16、.1.骨髓來源的MSCs為成纖維樣細胞的細胞群體，以均一的、梭形的成纖維樣細胞為主。
　　 2.2.流式細胞術(shù)分析結(jié)果:MSCs不表達CD34、CD45表面分子，而表達CD29、CD44、CD73、CD105、CD166等表面分子。
　　 2.3.MSCs經(jīng)體外誘導可分別向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞定向分化。誘導形成的成骨細胞用茜素紅染色可見大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié);誘導的成軟骨細胞用阿爾新藍進行染色，胞核和胞質(zhì)均被染成深

17、藍色，細胞質(zhì)染色更深，細胞和輪廓清晰。誘導形成的脂肪細胞光鏡下可見圓形脂滴，油紅O染色脂滴呈橙紅色。
　　 2.4.未發(fā)現(xiàn)細菌、真菌、病毒、支原體的污染，細胞輸注前的無血清處理，細胞生長良好，未見異常情況。人骨髓來源的MSCs經(jīng)NOD/SCID小鼠皮下接種一月后，未見有瘤樣組織形成。
　　 2.5.在添加bFGF的條件下，骨髓MSCs培養(yǎng)成功率為近100％，MSCs均能夠擴增到臨床治療所需的細胞數(shù)量。
　　 3.

18、結(jié)論:
　　 3.1.成功地進行了臨床應用組人骨髓來源的MSCs的分離、培養(yǎng)及擴增。
　　 3.2.形態(tài)學、表型及體外多向誘導分化表明，分離、培養(yǎng)及擴增的細胞群中確實為具有多潛能成體干細胞特性的MSCs。bFGF可有效促進hMSCs的增殖，滿足臨床治療需要的細胞量。
　　 3.3.定期監(jiān)測細菌、真菌、病毒、支原體是保證細胞質(zhì)量的重要手段。成功建立有效體外擴增培養(yǎng)MSCs的質(zhì)控體系。
　　 第三部分：骨髓間

19、充質(zhì)干細胞治療難治性慢性移植物抗宿主病的臨床研究
　　 1.方法:
　　 2005年4月至2010年11月期間，應用骨髓間充質(zhì)干細胞治療廣東省人民醫(yī)院血液科22例難治性cGVHD患者，每位患者MSCs平均輸注細胞數(shù)為1.05(0.23～2.0)×106/kg，中位輸注次數(shù)2(1～6)次，MSCs輸注后中位隨訪時間為55.5(2.6-81.2)個月。并對MSCs治療前后進行綜合評估，記錄治療前后免疫抑制劑使用情況、比較治療

20、前后臨床癥狀、實驗室結(jié)果的變化（流式細胞術(shù)分析T淋巴細胞亞群變化，ELISA監(jiān)測Th1、Th2類細胞因子變化），探討MSCs治療難治性cGVHD的安全性、臨床療效及其可能的機制。
　　 2.結(jié)果:
　　 2.1.MSCs治療難治性cGVHD安全性評價:MSCs輸注前、中、后均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)輸注相關(guān)的急性不良反應，至末次隨訪，中位隨訪時間為55.50(2.60～81.20)個月，未發(fā)現(xiàn)異位組織的發(fā)生及誘發(fā)第二腫瘤。
　　

21、 2.2.MSCs治療難治性cGVHD療效評價:首次MSCs輸注后出現(xiàn)治療反應的中位時間為27.50天（1～100天），治療累積最佳治療反應出現(xiàn)的中位時間為9.15(0.50～30.20)個月。17例(77.273％)獲得治療反應，其中CR4例，PR13例。在22例患者中，在末次隨訪時，生存(72.70％)16例，僅1例CML患者于MSCs輸注后41.40個月出現(xiàn)分子生物學復發(fā)，經(jīng)干擾素治療再次獲得CMR持續(xù)至今，其余15例均無發(fā)生原

22、發(fā)病復發(fā)或者繼發(fā)第二腫瘤。69.231％的存活患者可成功減用甚至停免疫抑制劑，其中5例停用免疫抑制劑，2、3年預期生存率分別為81.3％和71.1％。
　　 2.3.MSCs治療有效組，臨床癥狀好轉(zhuǎn)同時伴有CD8+CD28-T淋巴細胞（59.050±14.219％VS.40.870±19.794％，P=0.020）、Th1類細胞因子IL-2(346.045±99.148pg/mlVS226.067±99.148pg/ml,P=0

23、.001)和IFN-γ(41.891±20.075pg/mlVS31.604±12.240pg/ml，P=0.013)均較治療前升高;而Th2類細胞因子IL-10(66.122±22.825pg/mlVS88.418±34.298pg/ml，P=0.008)和IL-4(144.407±65.018pg/mlVS215.788±75.168pg/ml，P=0.001)較治療前分泌減少。相關(guān)性分析提示CD8+CD28-T淋巴細胞與Th1類細

24、胞因子呈正相關(guān)(△IL-2∶rp=0.537，P=0.026;△IFN-γ∶rp=0.723，P=0.001）;與Th2類細胞因子呈負相關(guān)(△IL-4∶rp=-0.554，P=0.021)。
　　 2.4.MSCs與CD8+T細胞共培養(yǎng)實驗顯示:CD8+CD28-T淋巴細胞比例上升。
　　 3.結(jié)論:
　　 3.1.體外擴增骨髓MSCs治療難治性cGVHD安全有效，不增加復發(fā)率。
　　 3.2.MSCs可