人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性移植物抗宿主病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本課題通過從人牙齦組織提取牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(GMSCs)，鑒定其表型并比較其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ASCs）在體內(nèi)與體外免疫調(diào)節(jié)功能的差異；分析其在體外對(duì) B淋巴細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)功能，并探討其相關(guān)的分子機(jī)制；同時(shí)建立慢性移植物抗宿主病小鼠模型，并向其體內(nèi)輸注GMSCs，觀察GMSCs在體內(nèi)對(duì)慢性移植物抗宿主病的治療作用，從而為間充質(zhì)干細(xì)胞治療相關(guān)免疫疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：分別從人體組

2、織分離出GMSCs，BMSCs與ASCs，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增并鑒定其表型。將三種間充質(zhì)干細(xì)胞分別與 T細(xì)胞共培養(yǎng)，加入 CD3/CD28磁珠，檢測(cè)其在體外抑制T細(xì)胞擴(kuò)增的功能；NOD小鼠輸注人外周血單核細(xì)胞建立異種GVHD模型，分別從尾靜脈輸注以上三種間充質(zhì)干細(xì)胞，比較其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能。為了研究GMSCs對(duì)B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，分選人B細(xì)胞，在CD40L與IL-4的作用下，與GMSCs共同培養(yǎng)，以纖維組織母細(xì)胞(Fibroblast)為對(duì)照，

3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞擴(kuò)增情況，細(xì)胞因子流式分析和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)相關(guān)因子和免疫球蛋白的表達(dá)水平以及B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞或調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的情況。由于B細(xì)胞能夠作為抗原提呈細(xì)胞激活T細(xì)胞的增生，將處理后的B細(xì)胞與T細(xì)胞在抗CD3抗體的作用下共培養(yǎng)，檢測(cè)B細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞活化與增殖的情況，最后在B細(xì)胞與牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，加入多種免疫相關(guān)信號(hào)蛋白的中和抗體，探討相關(guān)分子機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立人源化的小鼠慢性移植物抗宿主病模型，從

4、尾靜脈輸注 GMSCs，分析相關(guān)免疫性疾病的發(fā)展情況與嚴(yán)重度變化。
　　結(jié)果：我們成功在體外提取并培養(yǎng)出具有功能且表型正常的 GMSCs，它較BMSCs與ASCs有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能和體外擴(kuò)增能力。GMSCs能夠在體外抑制B細(xì)胞的增殖，而這種效應(yīng)不需要依賴細(xì)胞接觸就能夠?qū)崿F(xiàn)；GMSCs能夠降低漿細(xì)胞的生成，促進(jìn)B細(xì)胞向調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化；GMSCs還能夠降低B細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白水平，增加其抗炎癥因子的分泌。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)TGF-β受