STAT3信號通路對大腸癌腫瘤血管生成的影響及其作用機理的初步研究.pdf

1、目的：(1)探討大腸癌組織中STAT3表達，并研究STAT3表達與腫瘤血管生成的相關(guān)性。
　　 (2)觀察STAT3基因沉默對大腸癌HT-29細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞周期變化的影響。
　　 (3)觀察STAT3基因沉默對大腸癌HT-29細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長的影響。
　　 (4)在裸鼠體內(nèi)觀察STAT3信號對腫瘤血管生成的影響，并初步探討其作用機理。
　　 方法：
　　 (1)取臨床大腸癌石蠟標(biāo)本，免

2、疫組化檢測STAT3、CD34的表達情況，通過CD34的表達情況計數(shù)MVD，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析STAT3表達與MVD的相關(guān)性。
　　 (2)設(shè)計合成3對靶向STAT3基因的siRNA序列，通過篩選獲得最佳siRNA序列，構(gòu)建shRNA表達序列并連接到慢病毒載體pRNAT-U6.2/Lenti中，獲得pRNAT-shSTAT3重組慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，進行包裝產(chǎn)生病毒液，測定其滴度。將包裝獲得的病毒液感染大腸癌HT-

3、29細(xì)胞，篩選擴增獲得陽性細(xì)胞株HT-29-shSTAT3。同法，用慢病毒空質(zhì)粒包裝后產(chǎn)生的病毒液感染大腸癌HT-29細(xì)胞，篩選獲得陽性克隆細(xì)胞株HT-29-GFP。Real-timePCR和Westernblot檢測shRNA對STAT3基因的沉默效率，MTT法檢測細(xì)胞生長情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。
　　 (3)分別將HT-29、HT-29-GFP、HT-29-shSTAT3細(xì)胞注射入裸鼠皮下成瘤，定期測量各組腫瘤體積

4、變化。
　　 (4)30天后處死裸鼠，取各組瘤組織通過免疫組化檢測STAT3和CD34的表達情況，并計數(shù)MVD。血管生成基因芯片檢測腫瘤組織內(nèi)血管生成和抑制因子的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)臨床大腸癌組織中STAT3蛋白表達陽性率為63.6％，顯著高于正常大腸組織；大腸癌組織中MVD為47.55±12.15，而正常大腸組織中MVD為11.67±1.08，兩者相比具有顯著差異(P<0.01）；大腸癌組織中

5、STAT3的表達和MVD與腫瘤的惡性程度、Duke's分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。相關(guān)分析表明STAT3表達與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.788)。
　　 (2)酶切鑒定和測序結(jié)果證實STAT3shRNA核苷酸序列插入正確，成功包裝后產(chǎn)生病毒懸液的滴度為2×107TU/ml。病毒感染大腸癌HT-29細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，Real-timePCR和Westernblot分別顯示HT-29-shSTAT3細(xì)胞

6、STAT3mRNA的表達和蛋白明顯減弱，表達量分別為16.9±2.1％、18.8±2.4％(P<0.01)。MTT結(jié)果顯示STAT3基因沉默后的大腸癌HT-29細(xì)胞生長明顯減慢，Go/G1期細(xì)胞占68.73±2.88％，S期細(xì)胞占22.93±1.10％，與對照組相比差異顯著(P<0.01）。
　　 (3)各組裸鼠在接種腫瘤細(xì)胞后均成瘤，至接種后第15天，HT-29-shSTAT3細(xì)胞接種組腫瘤體積明顯小于HT-29和HT-29-

7、GFP細(xì)胞接種組(P<0.05)；至接種后第30天差異更為顯著（P<0.01），腫瘤生長抑制率為57.46％。
　　 (4)取腫瘤組織行免疫組化檢查，見HT-29和HT-29-GFP組腫瘤內(nèi)有多量的微血管分布，MVD分別為28.73±5.11，27.60±4.27，兩者無顯著差異(P>0.05）；而HT-29-shSTAT3組微血管明顯減少，MVD為9.80±3.02，與前兩組相比，差異顯著(P<0.01)。
　　 (5

8、)血管生成基因芯片結(jié)果提示在HT-29-shSTAT3裸鼠組大腸癌組織中，表達下調(diào)的基因有15條，上調(diào)的基因有7條。
　　 結(jié)論：
　　 (1)臨床大腸癌組織中存在STAT3的高表達，STAT3的表達可能在大腸癌的病程發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。大腸癌的發(fā)生過程中STAT3信號與腫瘤血管的生成密切相關(guān)。
　　 (2)STAT3信號通路對于大腸癌HT-29細(xì)胞生長起著重要的作用，沉默STAT3基因表達的大腸癌H

9、T-29細(xì)胞生長速度明顯減慢，細(xì)胞阻滯于G0/G1期。
　　 (3)抑制STAT3信號可以抑制大腸癌HT-29細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長。
　　 (4)在大腸癌組織中，STAT3信號可以促進腫瘤血管生成。
　　 (5)在大腸癌腫瘤血管生成過程中，STAT3信號可能通過調(diào)控VEGF-A、MMP-2、ECGF1、EPHB4、IGF1、NRP1、NRP2、STAB1、TNF、VEGFR-1、BAI1的表達來促進新生血管的