消退素D1對LPS誘導肺成纖維細胞COXs及其產物PGE2和PGD2的影響.pdf

1、本研究共分為三部分。
　　 第一部分 LPS刺激肺成纖維細胞后COXs及其產物PGE2和PGD2表達的時程變化
　　 目的:探討LPS刺激HFL-1及原代鼠肺成纖維細胞后COXs(COX-1和COX-2)及其產物PGE2，PGD2表達的時程變化
　　 方法:
　　 在體外培養(yǎng)HFL-1（人胚肺成纖維細胞株）或原代培養(yǎng)肺成纖維細胞，將HFL-1或原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞隨機均勻接種到六孔板:分別以LPS刺激

2、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時后提取細胞蛋白標本及細胞培養(yǎng)上清液標本，分別檢測在LPS刺激后不同時間點COX1/COX-2和PGE2/PGD2的表達情況。
　　 結果:
　　 檢測COX-2蛋白表達情況發(fā)現，LPS刺激HFL-1后，COX-2蛋白表達呈雙峰，分別在第6小時和第48小時。LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞后，COX-2蛋白表達亦呈雙峰，分別在第6小時和第48小時，且第二個峰較第一個峰更明顯。與此

3、同時，以ELISA檢測PGE2和PGD2表達水平，在HFL-1和原代大鼠肺成纖維細胞實驗中，PGE2表達均在第6小時組達最高峰，相反，PGD2表達在第48小時達最高水平。LPS刺激HFL-1及原代大鼠肺成纖維細胞后COX-1蛋白表達無明顯變化。
　　 結論:
　　 LPS刺激肺成纖維細胞后COX-2蛋白呈雙峰表達，開始在第6小時，第二高峰在第48小時;而COX-1蛋白的表達無明顯變化。與此同時，伴隨PGE2表達高峰在第6

4、小時，而PGD2的表達高峰在第48小時。
　　 第二部分 消退素D1對LPS刺激肺成纖維細胞后第6小時和第48小時COXs及其產物PGE2和PGD2表達的影響
　　 目的:探討消退素D1對LPS刺激HFL-1及原代大鼠肺成纖維細胞后第6小時和第48小時COXs及其產物PGE2，PGD2表達的影響
　　 方法:
　　 1、消退素D1對LPS刺激HFL-1細胞后6小時COXs及其產物PGE2，PGD2表達的影

5、響。實驗分為七組:1）正常對照組;2）LPS刺激組;3) LPS+RvD1(10nM)組;4）LPS+RvD1(50nM)組;5)LPS+RvD1(100nM)組;6）LPS+乙醇組;7）RvD1(100nM)組。消退素D1對LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞后6小時COXs及其產物PGE2，PGD2表達的影響體。實驗分為五組:1）正常對照組;2）LPS刺激組;3）LPS+RvD1(100nM)組;4)LPS+乙醇組;5）RvD1(100n

6、M)組。
　　 2、消退素D1對LPS刺激HFL-1細胞后48小時COXs及其產物PGE2，PGD2表達的影響體。實驗分為七組:1）正常對照組;2）LPS刺激組;3）LPS+RvD1(10nM)組;4)LPS+RvD1(50nM)組;5）LPS+RvD1(100nM)組;6)LPS+乙醇組;7）RvD1(100nM)組。消退素D1對LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞后48小時COXs及其產物PGE2，PGD2表達的影響體。實驗分為五

7、組:1）正常對照組;2）LPS刺激組;3）LPS+RvD1(100nM)組;4）LPS+乙醇組;5）RvD1(100nM)組。
　　 所有實驗組提取標本后，檢測COX1/COX-2和PGE2/PGD2的表達情況。
　　 結果:
　　 1.在研究消退素D1對LPS刺激HFL-1細胞后6小時COXs及其產物表達影響的實驗中，消退素D1能夠劑量依賴性抑制COX-2蛋白表達。消退素D1同樣能夠顯著抑制LPS刺激原代大鼠肺

8、成纖維細胞后6小時COX-2蛋白表達。然而，消退素D1對LPS刺激HFL-1及原代大鼠肺成纖維細胞后6小時COX-1蛋白表達均無明顯影響。另外，通過ELISA檢測以上各實驗組中細胞培養(yǎng)上清液PGE2和PGD2表達水平，結果發(fā)現，在HFL-1細胞株實驗中，消退素D1能劑量依賴性降低PGE2表達水平，在原代鼠肺成纖維細胞實驗中，100nM消退素D1能明顯降低PGE2表達水平。相反，雖然LPS刺激HFL-1及原代大鼠肺成纖維細胞后6小時PGD

9、2表達水平增加，但消退素D1對其影響均不明顯。
　　 2.在LPS刺激HFL-1細胞后48小時實驗中，消退素D1能夠劑量依賴性增加COX-2蛋白表達。消退素D1同樣能夠顯著增加LPS刺激原代鼠肺成纖維細胞后48小時COX-2蛋白表達。然而，消退素D1對LPS刺激HFL-1及原代鼠肺成纖維細胞后48小時COX-1蛋白表達均無明顯影響。另外，同樣檢測以上各實驗組中細胞培養(yǎng)上清液中PGE2和PGD2表達水平，結果發(fā)現，在HFL-1細胞

10、株實驗中，消退素D1能劑量依賴性增加PGD2表達水平，在原代大鼠肺成纖維細胞實驗中，100nM消退素D1能明顯增加PGD2表達水平。相反，消退素D1對LPS刺激HFL-1及原代大鼠肺成纖維細胞后48小時PGE2表達水平均無明顯影響。
　　 結論:
　　 消退素D1能明顯抑制LPS刺激肺成纖維細胞6小時后COX-2及其產物PGE2的表達，相反，卻能明顯增加LPS刺激肺成纖維細胞48小時后COX-2及其產物PGD2的表達。<

11、br>　　 第三部分 消退素D1雙向調控LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞后COX-2表達的作用機制
　　 目的:探討消退素D1雙向調控LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞后COX-2表達的作用機制。
　　 方法:
　　 1.研究LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞6小時和48小時后是否通過ERK1/2或PI3K/Akt信號通路介導，通過分別給予ERK1/2(UO126)和PI3K/Akt(LY294002)通路的特異性抑制劑

12、后檢測COX-2蛋白表達水平。
　　 2.消退素D1對LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞后PI3K/AKT和ERK1/2通路活化的影響，通過檢測了p-AKT和p-ERK1/2水平。
　　 結果:
　　 1.LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞6小時后COX-2蛋白表達部分通過ERK1/2和PI3K/Akt信號通路介導;然而LPS刺激原代大鼠肺成纖維細胞48小時后COX-2蛋白表達并非通過ERK1/2和PI3K/Akt信號通