前列腺素E2(PGE2)對ET-1誘導心肌肥厚的影響及其機制研究.pdf

1、背景:
　　心肌肥大是心肌重塑的一種形式，在生理性和病理性情況下均可出現(xiàn)。心肌肥大表現(xiàn)為心臟體積增大，主要原因為細胞內肌原纖維的量增加，而心肌細胞本身的數(shù)量并沒有發(fā)生變化。引起心臟肥大的原因較多，高血壓性心臟病、缺血性疾病等均可誘發(fā)。內皮素-1（endothelin-1,ET-1）是由內皮細胞產生的一種強效收縮肽，也可由心肌細胞分泌產生。ET-1被證明在促進心肌肥大發(fā)展的過程中起到了重要作用。有文獻指出心力衰竭大鼠血漿中ET-1的

2、水平較對照組顯著增加，并且升高的心肌ET-1有助于心臟功能的維持。
　　前列腺素類物質是來自20碳不飽和脂肪酸如花生四烯酸等的環(huán)氧產物。在機體遭受刺激時可由多種體內的細胞合成并迅速釋放出來，并以旁分泌或自分泌的形式作用于相關組織和器官以維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。前列腺素E2(PEG2)是所有前列腺素類物質中分布最為廣泛的一類，在大多數(shù)哺乳類動物中發(fā)揮著重要的生物學功能。PGE2通過其4個不同的受體發(fā)揮作用，分別為EP1，EP2，EP3，E

3、P4。這四種受體分別由不同的基因編碼。在針對心肌肥大的動物實驗中，有人發(fā)現(xiàn)抑制PGE2的合成能顯著抑制心肌梗死大鼠的心肌肥大性改變，同時還可以改善大鼠現(xiàn)有的心肌功能。同時，PGE2還被發(fā)現(xiàn)在左心室肥大的心肌組織中含量增加。上述結果均提示 PGE2可能對心肌細胞肥大的發(fā)生發(fā)展起到一定的作用。
　　高遷移率族蛋白B-1(High mobility group box1,HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，其作用因HMGB1所處的位置而

4、不同。核內的HMGB1具有調控DNA穩(wěn)定、復制、轉錄和翻譯等功能。但在組織損傷和細胞受到刺激后，HMGB1可被分泌到細胞外，發(fā)揮其晚期炎癥因子的作用。具體過程為：胞外HMGB1刺激炎癥因子釋放，引發(fā)炎癥反應，繼而炎癥因子又促進HMGB1釋放，在一定范圍內形成正反饋，維持和擴大炎癥反應。已有研究證實核內HMGB1水平升高具有抑制心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的作用。
　　已經有研究證實PGE2合成通路上的重要的限速酶之一，環(huán)氧合酶2(COX-2)

5、在ET-1誘導的心肌肥大中發(fā)揮了重要作用，且PGE2也參與了其中的具體過程。本研究旨在更進一步探討PGE2作用于心肌肥厚的具體機制，并研究PGE2及其受體通路在調控心肌細胞中HMGB1核轉位所起的作用。研究將建立ET-1誘導的大鼠心肌肥厚模型，檢測PGE2及ET-1對心肌細胞內HMGB1表達與分泌情況，同時觀察其對心肌肥厚進展的影響。
　　目的:
　　探討PGE2是否可通過調控HMGB1在心肌細胞的核轉位從而影響心肌肥厚的發(fā)

6、生發(fā)展，并進行初步機制研究。
　　材料與方法:
　　1.主要試劑和儀器
　　所需試劑：內皮素（ET-1）和前列腺素E2(PGE2)購自美國Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo)公司；EP1-4受體拮抗劑(ONO-8711, EP1拮抗劑;AH-6809, EP2拮抗劑;DG-041, EP3拮抗劑;AH-23848, EP4拮抗劑)以及PGE2 ELISA Kit購自美國Cayman公司（MI, US

7、A）；DMEM/F12細胞培養(yǎng)基，I、II型膠原酶購自美國Gibco公司，細胞培養(yǎng)用青霉素和鏈霉素購于中國華北制藥股份有限公司。胎牛血清及 EDTA購自美國 Hyclone公司?？?HMGB1抗體購自于英國 Cell Signaling Technology公司，抗histone H3抗體購于美國cayman公司。
　　2實驗方法
　　2.1心肌細胞培養(yǎng)
　　收集出生1-2天新生大鼠，斷頭術處死后取心臟置于盛有培養(yǎng)基的

8、培養(yǎng)皿內。小心分離心室部位并將心肌組織剪成大約1mm3左右的碎塊，將碎片組織轉入無菌容器中加入消化液（膠原酶II及胰蛋白酶），置于37°恒溫水浴箱中消化10min，棄上清。繼續(xù)補充消化液后按照以上步驟重復3次。將所有消化后的上清液收集后離心，沉淀用細胞培養(yǎng)基終止消化后通過吹打制成細胞懸液，200目尼龍網過濾后收集心肌細胞置于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。
　　2.2總RNA提取及實時定量RT-PCR
　　總RNA提取采取Invitrog

9、en TRIzol法進行。將培養(yǎng)的心肌細胞離心后計數(shù)，以1ml/1×107細胞的濃度放入盛有TRIzol溶液的無菌離心管中，加入200μl氯仿后震蕩混勻，4℃離心后收集上清，加入異丙醇0.5ml混勻，放置10分鐘后4℃離心。棄上清，管中繼續(xù)加入75％乙醇1ml混合后4℃離心，小心吸干水分，徹底干燥后加入1ml RNAse-free H2O進行溶解。檢測濃度與純度并低溫保存。
　　逆轉率反應按照 Invitrogen Supersc

10、riptⅢ逆轉錄酶試劑盒說明書進行。將5μg提取的總RNA置于無RNA酶的PCR反應管內，溶解于適量的DEPC-treated H2O中使其總體積達到11μl，在管中繼續(xù)加入10μM的oligo(dT)18primer約0.5μl，輕微震蕩混勻后離心5秒鐘，70℃加熱5-10分鐘后即放入冰上冷卻至少1分鐘。隨后向反應體系中加入5×reaction buffer4μl，RibolockTM Ribonuclease inhibitor1μ

11、l，10mM dNTP mix2μl。小心震蕩混勻后再次離心5秒鐘，37℃加熱5分鐘。之后再加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/ul)1μl，混勻后42℃水浴中孵育60分鐘，并于70℃加熱10分鐘以終止反應。收集反應產物置于冰上保存?zhèn)溆谩?br>　　Real-time RT-PCR所需引物序列由Gene bank查出，引物合成由TaKaRa生物工程公司負責。反應體系為：SYBR

12、 superMix熒光混合物10μl，上游+下游引物1μl，三蒸水5μl，cDNA4μl,最終反應體積20μl。反應條件為：95℃8分鐘，95℃15秒，退火溫度45秒，72℃30秒，72℃7分鐘；共45個循環(huán)。
　　2.3 western blot
　　將培養(yǎng)皿內的心肌細胞用0.25%的胰蛋白酶進行消化，收集后進行細胞計數(shù)。用預冷的PBS洗滌細胞，1500轉離心5分鐘后棄上清，將沉淀加入細胞裂解液4℃條件下放置10分鐘，所得

13、上清即為細胞裂解物。在上清中加入2×SDS loading buffer后100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白質變性，可以直接上樣或者-20℃長期保存。總蛋白提取完畢后可按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒的說明進行蛋白濃度檢測，根據(jù)濃度確定蛋白上樣量，經過電泳、轉膜、雜交、顯色后得出目的蛋白條帶。
　　2.4 細胞表面積測量
　　心肌細胞表面積的測定參考以往文獻進行。首先將心肌細胞轉移至48孔培養(yǎng)板中，并在室溫下用4%多聚甲醛固定10

14、min。隨后加入0.5%Triton-100處理5分鐘。處理完畢后加入0.1%羅丹明鬼筆環(huán)肽進行染色，時間約為30分鐘。每孔測量7個視野，每個視野包括5-10個心肌細胞，測量50個心肌細胞的面積，每組重復測量三次。細胞圖像由高通量篩查系統(tǒng)（ Thermo Fisher Scientific, Rockford,USA）進行分析并通過內置的圖像軟件測定細胞面積。
　　2.5 PGE2酶聯(lián)免疫檢測
　　本次檢測采用從Cayman

15、公司購買的PGE2 EIA試劑盒，用來測量體外培養(yǎng)的心肌細胞分泌出來的PGE2含量。將細胞以1*105/孔的濃度接種于試劑盒提供的96孔板中。每個孔內分別加入50μL的PGE2單克隆抗體、50μL的PGE2 tracer及50μL的標準品或待測樣品。在4°條件下孵育18小時后棄掉板中液體，采用配備的washing buffer進行洗滌，共5次。隨后每孔再加入20μL的Ellman’s試劑,室溫情況下孵育60-90分鐘。在405nm波長下

16、進行讀板,并記錄數(shù)值。
　　結果:
　　1.ET-1促進乳鼠心肌細胞內PGE2的分泌
　　我們已知ET-1作為誘導心肌肥大的體外刺激劑而被廣泛使用，因此在本實驗中，我們首先研究了在ET-1誘導的乳鼠心肌肥大模型中PGE2的分泌情況。研究結果發(fā)現(xiàn)ET-1可以促進心肌細胞中PGE2的分泌。且該促進作用具有劑量依賴性，即隨著ET-1劑量的增加，心肌細胞分泌PGE2的量也逐漸增加。此外， ELISA結果還顯示采用同樣濃度ET-

17、1進行刺激時，刺激時間的不同也可以導致PGE2分泌水平的不同。研究發(fā)現(xiàn)ET-1促進心肌細胞分泌PGE2的能力在12小時的時候達到高峰，之后便出現(xiàn)下降趨勢。ET-1作用24小時后PGE2的分泌量小于作用12小時后的分泌量。
　　2.減少PGE2的生成可以抑制ET-1誘導心肌肥大的進展
　　為了進一步研究PGE2在ET-1誘導的心肌肥大中的作用，我們接下來引入了PGE2合成通路中限速酶COXs的抑制劑吲哚美辛（indometha

18、cin）。首先將吲哚美辛與新生乳鼠的心肌細胞共同孵育45分鐘，用以抑制PGE2的合成，然后再加入ET-1和(或)PGE2進行刺激，并觀察乳鼠心肌細胞的肥大情況。研究發(fā)現(xiàn)單獨加入ET-1的組出現(xiàn)了心肌肥大的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為心肌細胞面積增大以及肥厚性標記基因ANF和BNP的RNA表達水平增加；而經過吲哚美辛提前孵育的細胞再加入ET-1后，其心肌肥大的表現(xiàn)低于ET-1組；研究同時還發(fā)現(xiàn)加入PGE2可以逆轉吲哚美辛所產生的抑制心肌肥大的作用。上

19、述結果提示我們PGE2通路在ET-1誘導的心肌肥大過程中起到了重要的促進作用。
　　3. PGE2與ET-1均可以調控HMGB1的核轉位
　　考慮到HMGB1對于心肌肥大具有一定的作用，且該作用因其在細胞內所處的位置而不同，我們接下來探討PGE2及ET-1是否具有調控HMGB1轉位的功能及其初步的可能性機制。研究發(fā)現(xiàn)在不給予任何刺激的情況下，HMGB1主要在心肌細胞核內表達，核外表達較少。加入ET-1或PGE2均可抑制HMG

20、B1在細胞核內的表達，并且促進其在胞漿中的表達，即促進 HMGB1由胞核向胞漿的轉位。而采用吲哚美辛對心肌細胞進行預孵育后再加入 ET-1，則可以逆轉ET-1所呈現(xiàn)的核轉位，使HMGB1由胞漿向胞核移動。同時，肥厚性標記基因ANF和BNP的RNA表達水平也出現(xiàn)了類似的變化。即單獨使用ET-1和PGE2是其表達水平升高，而加入吲哚美辛提前作用后則表達水平下降。因此，我們認為PGE2以及ET-1均具有調控HMGB1在心肌細胞內的核轉位作用，

21、且加入吲哚美辛可以逆轉這一功能。
　　4.乳鼠心肌細胞中PGE2調控的HMGB1核轉位主要由其受體EP4介導
　　為進一步確定PGE2通過何種受體調控肥大心肌細胞內HMGB1的核轉位過程，我們首先檢測了EP受體在小鼠心肌細胞的表達情況，結果顯示EP1-EP4受體均在心肌細胞中有表達。隨后我們將心肌細胞分組，分別給予PGE2，PGE2及不同受體（EP1-EP4）拮抗劑進行刺激，并提取心肌胞核蛋白檢測其中HMGB1的表達情況。結

22、果發(fā)現(xiàn)單獨加入PGE2組的心肌細胞核中HMGB1的表達下降，而加入PGE2+EP4拮抗劑組小鼠心肌細胞則可以逆轉這一現(xiàn)象，HMGB1的表達上升。因此我們推測EP4受體可能參與了這一過程。
　　結論:
　　本研究表明在離體心肌細胞中，ET-1可以促進 PGE2的分泌，而內源性或外源性的PGE2均具有促進ET-1誘導心肌肥大發(fā)展的作用。兩者的作用機制之一有可能是通過調控心肌細胞內HMGB1核位移實現(xiàn)的。研究證明ET-1和PGE2