PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)TBI大鼠海馬神經(jīng)元及記憶認(rèn)知功能的保護(hù)作用.pdf

1、外傷性腦損傷是神經(jīng)科的常見(jiàn)疾病,發(fā)病率極高,目前人們已經(jīng)清楚其病理學(xué)改變包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段。TBI后通過(guò)炎癥反應(yīng)、谷氨酸興奮毒性、自由基生成和脂質(zhì)過(guò)氧化、離子失衡、細(xì)胞凋亡等多種相關(guān)的病理機(jī)制導(dǎo)致腦損傷區(qū)周圍更廣泛的神經(jīng)元繼發(fā)性死亡,炎性反應(yīng)在其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究證實(shí)TBI后腦皮層和海馬等腦區(qū)發(fā)生的不可控性炎性反應(yīng),通過(guò)活化的星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞毒物質(zhì),引發(fā)大量神經(jīng)元損害及死亡是其主要病理機(jī)制之一。
　

2、　 過(guò)氧化物酶增殖因子活化受體γ是核激素受體超家族中的配體激活轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和炎性反應(yīng)中起重要作用。目前PPARγ激動(dòng)劑吡咯列酮(pioglitazone,Pio)在腦缺血、脊髓損傷、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、帕金森綜合癥等中樞神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型上的抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用備受關(guān)注。吡格列酮是噻唑烷二酮類藥物,為PPARγ的合成激動(dòng)劑。PPARγ與之結(jié)合后激活,能抑制細(xì)胞因子、黏附分子和金屬蛋白酶而抑制炎性細(xì)胞

3、從外周進(jìn)入中樞,能通過(guò)抑制NF-κB和JAK-STAT信號(hào)通路的活性而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的炎癥和氧化應(yīng)激。有實(shí)驗(yàn)證明PPARγ激動(dòng)劑能抑制原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑SOCS1、3的表達(dá),后者能通過(guò)降低JAK的磷酸化而抑制JAK-STAT信號(hào)通路,通過(guò)共價(jià)修飾一種抑制蛋白IκB激酶降低NF-κB的表達(dá)從而抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路。此外,吡咯列酮能抑制谷氨酸和低鉀導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。這提示PPARγ可能是中樞神

4、經(jīng)系統(tǒng)急慢性損傷治療的新靶點(diǎn)。
　　 臨床TBI后發(fā)生的認(rèn)知功能障礙是影響幸存者生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)對(duì)腦損傷性認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制仍不清楚,因而臨床缺少合理有效的治療。我們?cè)O(shè)想吡咯列酮能夠抑制TBI大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng),減少神經(jīng)元的死亡,從而改善動(dòng)物認(rèn)知行為。因此,本工作在自動(dòng)控制腦損傷撞擊儀制備的大鼠左側(cè)腦頂葉皮層損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和OX-42、GFAP和NeuN免疫組化染色的

5、方法,研究了吡咯列酮對(duì)大鼠記憶認(rèn)知行為和海馬CA1和CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)量的影響;在體外培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?觀察了吡格列酮對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的體外培養(yǎng)皮層和海馬神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。這對(duì)闡明TBI認(rèn)知功能障礙的病理機(jī)制,發(fā)現(xiàn)有效地治療藥物和手段具有重要理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 一、吡格列酮對(duì)TBI大鼠記

6、憶認(rèn)知功能的作用
　　 為證明吡格列酮能夠改善TBI大鼠的記憶認(rèn)知障礙,本工作采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(morris water maze,MWM)測(cè)試動(dòng)物通過(guò)空間位置覺(jué)和方向覺(jué)的學(xué)習(xí)記憶能力,進(jìn)而判斷其認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham組),腦損傷溶劑注射組(Vehicle組),吡格列酮治療組(Pio組)和吡格列酮+阻斷劑組(Pio+Ant組)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組大鼠找到水中平臺(tái)的潛伏期和游泳軌跡隨MWM訓(xùn)練次數(shù)的增多而縮短

7、,說(shuō)明大鼠具備空間學(xué)習(xí)與記憶能力。在MWM第2天到第4天各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較其潛伏期和游泳軌跡具有顯著性差異。取這3d各組數(shù)據(jù)均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Vehicle組大鼠MWM潛伏期和游泳軌跡分別為40.07±10.31s、851.58±209.95cm,較Sham組大鼠潛伏期19.59±6.42s及游泳軌跡477.27±190.12cm明顯增長(zhǎng)(P均＜0.01);Pio組大鼠潛伏期和游泳軌跡分別為21.82±6.90s和629.30±203

8、.37cm,比Vehicle組顯著縮短(P均＜0.05);應(yīng)用PPARγ阻斷劑T0070907后,潛伏期和游泳軌跡分別為39.81±10.64s、888.51±279.29cm,均比Pio組大鼠延長(zhǎng)(P均＜0.05)。分別將Pio組大鼠潛伏期和游泳軌跡與Sham組大鼠,以及Vehicle組與Pio+Ant組比較,兩者之間無(wú)顯著性差異。各組大鼠游泳速度無(wú)顯著性差異,說(shuō)明上述組間平臺(tái)潛伏期的差異不是由大鼠游泳能力變化引起的。結(jié)果提示大鼠皮層

9、頂葉中、內(nèi)側(cè)部撞擊傷可引起空間認(rèn)知功能的減弱,吡格列酮能夠通過(guò)PPARγ受體的介導(dǎo),提高TBI大鼠的空間認(rèn)知能力。
　　 二、吡格列酮對(duì)TBI大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的作用
　　 本實(shí)驗(yàn)在大鼠TBI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?利用OX-42免疫組化染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法,研究了吡格列酮對(duì)TBI大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎性反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,正常Sham組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀,體積小,突起細(xì)而短,染色淺;Vehicle組大鼠海馬小膠

10、質(zhì)細(xì)胞染色深,胞體增大,細(xì)胞為阿米巴狀,突起長(zhǎng)而粗,呈現(xiàn)活化小膠質(zhì)細(xì)胞的表征;應(yīng)用Pio后大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度明顯減弱,該效應(yīng)被T0070907翻轉(zhuǎn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示Vehicle組海馬CA1和CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為327±7.0個(gè),與Sham組206.6±8.9個(gè)相比,差異非常顯著(P＜0.01);Pio組為218±9.02個(gè),比Vehicle組顯著減少(P＜0.01),與Pio+Ant組324.2±4.91個(gè)比較,差別顯著(

11、P＜0.01)。結(jié)果提示TBI可引起大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化,吡咯列酮能夠通過(guò)PPARγ受體減弱TBI后大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)。
　　 三、吡格列酮對(duì)TBI大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用
　　 本實(shí)驗(yàn)在大鼠TBI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?利用GFAP免疫組化和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法,研究了吡格列酮對(duì)TBI大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sham組大鼠正常海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞呈星芒狀,突起分支細(xì)而少;而Vehicle組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)

12、胞染色明顯加深,突起分支增多、增粗、變長(zhǎng),分布密集,表現(xiàn)為活化狀態(tài);應(yīng)用Pio治療后大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度明顯較Vehicle大鼠減輕;Pio+Ant組大鼠海馬仍表現(xiàn)一定程度的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)得出Vehicle組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為216.44±33.94個(gè),較Sham組152.33±15.66個(gè)顯著增多(P＜0.01);Pio組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量是172.44±29.78個(gè),比Vehicle組或

13、Pio+Ant組201.16±30.51個(gè)明顯減少(P均＜0.05)。結(jié)果提示吡咯列酮可以減輕TBI大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化,PPARγ受體介導(dǎo)該效應(yīng)。
　　 四吡格列酮對(duì)TBI大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 本實(shí)驗(yàn)利用NeuN(神經(jīng)元核蛋白)免疫組化染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法,探討了吡格列酮能否通過(guò)減少TBI大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng),發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。結(jié)果顯示Sham組大鼠正常海馬神經(jīng)元排列整齊,

14、結(jié)構(gòu)層次分明、胞體和突起清晰可見(jiàn),NeuN蛋白表達(dá)強(qiáng);Vehicle組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較正常顯著減少、細(xì)胞腫脹、排列紊亂、邊界不清、NeuN染色變淺;而Pio治療組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞輪廓較TBI組和Pio+Ant組大鼠清晰飽滿、NeuN蛋白表達(dá)增強(qiáng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)得出,Sham組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量為253.50±9.33個(gè),Vehicle組為158.00±6.92個(gè),兩者比較差異非常顯著(P＜0.01);Pio組大鼠海

15、馬該區(qū)神經(jīng)元為199.66±8.87個(gè),較Vehicle組和Pio+Ant(160.66q±7.75個(gè))顯著增多(P＜0.05);Vehicle組與Pio+Ant組比較無(wú)顯著性差異。結(jié)果提示吡咯列酮能夠通過(guò)PPARγ增強(qiáng)TBI大鼠海馬神經(jīng)元NeuN蛋白表達(dá),減輕神經(jīng)元的損傷和死亡。
　　 五吡格列酮對(duì)體外培養(yǎng)的新生大鼠膽堿能神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的新生大鼠皮層和海馬膽堿能神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?利用ChAT免

16、疫細(xì)胞化學(xué)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法,研究了吡格列酮對(duì)LPS所致的膽堿能神經(jīng)元炎性反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control組),脂多糖致炎組(LPS組)和吡格列酮治療組(LPS+Pio組)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Control組大鼠正常膽堿能神經(jīng)元飽滿,胞體和突起清晰可見(jiàn),ChAT蛋白表達(dá)強(qiáng);LPS組大鼠膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較正常顯著減少、細(xì)胞腫脹、邊界不清、ChAT染色變淺;而Pio+LPS組大鼠膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞輪廓較LPS組大鼠清晰飽滿、突起多,細(xì)胞

17、間的突觸聯(lián)系多,ChAT蛋白表達(dá)增強(qiáng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示Control組的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為65.16±3.18個(gè)/視野,與LPS組33.83±3.43個(gè)/視野相比差異顯著(P＜0.01);Pio+LPS組ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為59.50±7.06個(gè)/視野比LPS組的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.01)。提示吡格列酮能夠直接降低LPS導(dǎo)致的新生大鼠皮層和海馬膽堿能神經(jīng)元的炎性損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.

18、吡格列酮能夠通過(guò)PPARγ介導(dǎo)提高TBI大鼠MWM的記憶認(rèn)知能力。
　　 2.吡咯列酮能夠通過(guò)PPARγ介導(dǎo)減弱TBI大鼠海馬CA1和CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化反應(yīng)。
　　 3.吡咯列酮能夠通過(guò)PPARγ介導(dǎo)減輕TBI大鼠海馬CA1和CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)。
　　 4.吡咯列酮能夠增強(qiáng)TBI大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元;NeuN蛋白表達(dá),減少神經(jīng)元的損傷和死亡。
　　 5.吡咯列酮具有對(duì)LPS所致