PPARγ激動劑吡格列酮對TBI大鼠海馬神經(jīng)元及記憶認知功能的保護作用.pdf

1、外傷性腦損傷是神經(jīng)科的常見疾病,發(fā)病率極高,目前人們已經(jīng)清楚其病理學改變包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段。TBI后通過炎癥反應、谷氨酸興奮毒性、自由基生成和脂質過氧化、離子失衡、細胞凋亡等多種相關的病理機制導致腦損傷區(qū)周圍更廣泛的神經(jīng)元繼發(fā)性死亡,炎性反應在其中發(fā)揮關鍵性作用。研究證實TBI后腦皮層和海馬等腦區(qū)發(fā)生的不可控性炎性反應,通過活化的星形膠質和小膠質細胞釋放細胞毒物質,引發(fā)大量神經(jīng)元損害及死亡是其主要病理機制之一。
　

2、　 過氧化物酶增殖因子活化受體γ是核激素受體超家族中的配體激活轉錄因子,在調控細胞增殖、分化和炎性反應中起重要作用。目前PPARγ激動劑吡咯列酮(pioglitazone,Pio)在腦缺血、脊髓損傷、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、帕金森綜合癥等中樞神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性疾病動物模型上的抗炎及神經(jīng)保護作用備受關注。吡格列酮是噻唑烷二酮類藥物,為PPARγ的合成激動劑。PPARγ與之結合后激活,能抑制細胞因子、黏附分子和金屬蛋白酶而抑制炎性細胞

3、從外周進入中樞,能通過抑制NF-κB和JAK-STAT信號通路的活性而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的炎癥和氧化應激。有實驗證明PPARγ激動劑能抑制原代培養(yǎng)的星形膠質細胞和小膠質細胞中細胞因子信號抑制劑SOCS1、3的表達,后者能通過降低JAK的磷酸化而抑制JAK-STAT信號通路,通過共價修飾一種抑制蛋白IκB激酶降低NF-κB的表達從而抑制NF-κB信號傳導通路。此外,吡咯列酮能抑制谷氨酸和低鉀導致的神經(jīng)毒性。這提示PPARγ可能是中樞神

4、經(jīng)系統(tǒng)急慢性損傷治療的新靶點。
　　 臨床TBI后發(fā)生的認知功能障礙是影響幸存者生活質量的關鍵因素?，F(xiàn)對腦損傷性認知功能障礙的病理生理機制仍不清楚,因而臨床缺少合理有效的治療。我們設想吡咯列酮能夠抑制TBI大鼠海馬區(qū)星形膠質和小膠質細胞炎性反應,減少神經(jīng)元的死亡,從而改善動物認知行為。因此,本工作在自動控制腦損傷撞擊儀制備的大鼠左側腦頂葉皮層損傷實驗模型上,利用Morris水迷宮實驗和OX-42、GFAP和NeuN免疫組化染色的

5、方法,研究了吡咯列酮對大鼠記憶認知行為和海馬CA1和CA3區(qū)小膠質細胞、星形膠質細胞和神經(jīng)元數(shù)量的影響;在體外培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)細胞實驗模型上,觀察了吡格列酮對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的體外培養(yǎng)皮層和海馬神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護作用。這對闡明TBI認知功能障礙的病理機制,發(fā)現(xiàn)有效地治療藥物和手段具有重要理論意義和臨床應用價值。
　　 主要實驗結果如下:
　　 一、吡格列酮對TBI大鼠記

6、憶認知功能的作用
　　 為證明吡格列酮能夠改善TBI大鼠的記憶認知障礙,本工作采用Morris水迷宮實驗(morris water maze,MWM)測試動物通過空間位置覺和方向覺的學習記憶能力,進而判斷其認知功能。實驗分為假手術組(Sham組),腦損傷溶劑注射組(Vehicle組),吡格列酮治療組(Pio組)和吡格列酮+阻斷劑組(Pio+Ant組)。結果發(fā)現(xiàn)各實驗組大鼠找到水中平臺的潛伏期和游泳軌跡隨MWM訓練次數(shù)的增多而縮短

7、,說明大鼠具備空間學習與記憶能力。在MWM第2天到第4天各實驗組兩兩比較其潛伏期和游泳軌跡具有顯著性差異。取這3d各組數(shù)據(jù)均值進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)Vehicle組大鼠MWM潛伏期和游泳軌跡分別為40.07±10.31s、851.58±209.95cm,較Sham組大鼠潛伏期19.59±6.42s及游泳軌跡477.27±190.12cm明顯增長(P均＜0.01);Pio組大鼠潛伏期和游泳軌跡分別為21.82±6.90s和629.30±203

8、.37cm,比Vehicle組顯著縮短(P均＜0.05);應用PPARγ阻斷劑T0070907后,潛伏期和游泳軌跡分別為39.81±10.64s、888.51±279.29cm,均比Pio組大鼠延長(P均＜0.05)。分別將Pio組大鼠潛伏期和游泳軌跡與Sham組大鼠,以及Vehicle組與Pio+Ant組比較,兩者之間無顯著性差異。各組大鼠游泳速度無顯著性差異,說明上述組間平臺潛伏期的差異不是由大鼠游泳能力變化引起的。結果提示大鼠皮層

9、頂葉中、內側部撞擊傷可引起空間認知功能的減弱,吡格列酮能夠通過PPARγ受體的介導,提高TBI大鼠的空間認知能力。
　　 二、吡格列酮對TBI大鼠海馬小膠質細胞的作用
　　 本實驗在大鼠TBI實驗模型上,利用OX-42免疫組化染色和細胞計數(shù)的方法,研究了吡格列酮對TBI大鼠海馬區(qū)小膠質細胞活化導致的炎性反應的影響。結果顯示,正常Sham組大鼠海馬小膠質細胞呈分支狀,體積小,突起細而短,染色淺;Vehicle組大鼠海馬小膠

10、質細胞染色深,胞體增大,細胞為阿米巴狀,突起長而粗,呈現(xiàn)活化小膠質細胞的表征;應用Pio后大鼠海馬小膠質細胞活化程度明顯減弱,該效應被T0070907翻轉。細胞計數(shù)結果顯示Vehicle組海馬CA1和CA3區(qū)小膠質細胞數(shù)量為327±7.0個,與Sham組206.6±8.9個相比,差異非常顯著(P＜0.01);Pio組為218±9.02個,比Vehicle組顯著減少(P＜0.01),與Pio+Ant組324.2±4.91個比較,差別顯著(

11、P＜0.01)。結果提示TBI可引起大鼠海馬小膠質細胞的增殖活化,吡咯列酮能夠通過PPARγ受體減弱TBI后大鼠海馬小膠質細胞的炎性反應。
　　 三、吡格列酮對TBI大鼠海馬星形膠質細胞的作用
　　 本實驗在大鼠TBI實驗模型上,利用GFAP免疫組化和細胞計數(shù)的方法,研究了吡格列酮對TBI大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞的反應。結果發(fā)現(xiàn)Sham組大鼠正常海馬星形膠質細胞呈星芒狀,突起分支細而少;而Vehicle組大鼠海馬星形膠質細

12、胞染色明顯加深,突起分支增多、增粗、變長,分布密集,表現(xiàn)為活化狀態(tài);應用Pio治療后大鼠海馬星形膠質細胞活化程度明顯較Vehicle大鼠減輕;Pio+Ant組大鼠海馬仍表現(xiàn)一定程度的星形膠質細胞反應。細胞計數(shù)得出Vehicle組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)量為216.44±33.94個,較Sham組152.33±15.66個顯著增多(P＜0.01);Pio組星形膠質細胞數(shù)量是172.44±29.78個,比Vehicle組或

13、Pio+Ant組201.16±30.51個明顯減少(P均＜0.05)。結果提示吡咯列酮可以減輕TBI大鼠海馬星形膠質細胞的增殖活化,PPARγ受體介導該效應。
　　 四吡格列酮對TBI大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用
　　 本實驗利用NeuN(神經(jīng)元核蛋白)免疫組化染色和細胞計數(shù)的方法,探討了吡格列酮能否通過減少TBI大鼠小膠質細胞和星形膠質細胞炎性反應,發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護作用。結果顯示Sham組大鼠正常海馬神經(jīng)元排列整齊,

14、結構層次分明、胞體和突起清晰可見,NeuN蛋白表達強;Vehicle組大鼠海馬神經(jīng)元細胞數(shù)量較正常顯著減少、細胞腫脹、排列紊亂、邊界不清、NeuN染色變淺;而Pio治療組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞輪廓較TBI組和Pio+Ant組大鼠清晰飽滿、NeuN蛋白表達增強。細胞計數(shù)得出,Sham組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量為253.50±9.33個,Vehicle組為158.00±6.92個,兩者比較差異非常顯著(P＜0.01);Pio組大鼠海

15、馬該區(qū)神經(jīng)元為199.66±8.87個,較Vehicle組和Pio+Ant(160.66q±7.75個)顯著增多(P＜0.05);Vehicle組與Pio+Ant組比較無顯著性差異。結果提示吡咯列酮能夠通過PPARγ增強TBI大鼠海馬神經(jīng)元NeuN蛋白表達,減輕神經(jīng)元的損傷和死亡。
　　 五吡格列酮對體外培養(yǎng)的新生大鼠膽堿能神經(jīng)元的保護作用
　　 本實驗在體外培養(yǎng)的新生大鼠皮層和海馬膽堿能神經(jīng)元實驗模型上,利用ChAT免

16、疫細胞化學染色及細胞計數(shù)的方法,研究了吡格列酮對LPS所致的膽堿能神經(jīng)元炎性反應的影響。實驗分為對照組(Control組),脂多糖致炎組(LPS組)和吡格列酮治療組(LPS+Pio組)。結果發(fā)現(xiàn)Control組大鼠正常膽堿能神經(jīng)元飽滿,胞體和突起清晰可見,ChAT蛋白表達強;LPS組大鼠膽堿能神經(jīng)元細胞數(shù)量較正常顯著減少、細胞腫脹、邊界不清、ChAT染色變淺;而Pio+LPS組大鼠膽堿能神經(jīng)元細胞輪廓較LPS組大鼠清晰飽滿、突起多,細胞

17、間的突觸聯(lián)系多,ChAT蛋白表達增強。細胞計數(shù)顯示Control組的ChAT陽性細胞數(shù)為65.16±3.18個/視野,與LPS組33.83±3.43個/視野相比差異顯著(P＜0.01);Pio+LPS組ChAT陽性細胞數(shù)為59.50±7.06個/視野比LPS組的細胞數(shù)明顯增多(P＜0.01)。提示吡格列酮能夠直接降低LPS導致的新生大鼠皮層和海馬膽堿能神經(jīng)元的炎性損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)元的保護作用。
　　 結論:
　　 1.

18、吡格列酮能夠通過PPARγ介導提高TBI大鼠MWM的記憶認知能力。
　　 2.吡咯列酮能夠通過PPARγ介導減弱TBI大鼠海馬CA1和CA3區(qū)小膠質細胞的增殖活化反應。
　　 3.吡咯列酮能夠通過PPARγ介導減輕TBI大鼠海馬CA1和CA3區(qū)星形膠質細胞的反應。
　　 4.吡咯列酮能夠增強TBI大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元;NeuN蛋白表達,減少神經(jīng)元的損傷和死亡。
　　 5.吡咯列酮具有對LPS所致