PITX1基因在骨肉瘤中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、骨肉瘤是高度惡性的原發(fā)骨腫瘤，多見(jiàn)于兒童、青少年，臨床治療難度大，治愈率低。目前通常采取手術(shù)，放、化療等為主的綜合治療手段，盡管應(yīng)用新輔助化療法明顯提高了患者生存率，但近30年來(lái)，骨肉瘤的治療方面的進(jìn)展較為緩慢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，骨肉瘤的5年生存率及總生存率均在60％左右，即使是運(yùn)用了聯(lián)合治療手段，仍有大約40％患者最終死于骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。另外，化療毒副反應(yīng)嚴(yán)重，耐藥性的出現(xiàn)也使現(xiàn)有化療手段陷入困境。骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制至今仍然沒(méi)有得到很好

2、的闡明。因此，對(duì)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找特異性基因治療靶點(diǎn)，將有助于我們更早、更準(zhǔn)確的診斷，以及開(kāi)發(fā)新的、安全有效的理想治療方案。
　　PITX1（paired-like homeodomain trancription factor1，PITX1）基因在人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并逐步被證實(shí)為抑癌基因。PITX1作為抑癌基因參與腫瘤調(diào)節(jié)過(guò)程是通過(guò)抑制PITX1的表達(dá)，誘導(dǎo)人原始細(xì)胞的致癌信號(hào)

3、，從而激活Ras，促使細(xì)胞無(wú)限增殖，導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Liu DX等人進(jìn)一步確證了PITX1作為一抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。并指出，PITX1是P53的上游轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)P53影響乳腺癌的發(fā)展。但PITX1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制國(guó)內(nèi)外仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬檢測(cè)PITX1基因在骨肉瘤中的表達(dá)情況，并初步探討其臨床意義及調(diào)控分子機(jī)制，為骨肉瘤的早期診斷及尋找新的、更為有效的治療方法提供理論依據(jù)

4、。
　　方法：
　　第一部分：PITX1在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義
　　1.收集骨肉瘤及正常骨組織蠟塊標(biāo)本，制成石蠟切片。
　　2.免疫組織學(xué)分析，檢測(cè)PITX1蛋白在正常骨組織及骨肉瘤組織中的表達(dá)情況。
　　3.收集相應(yīng)骨肉瘤患者臨床信息資料，并按一定標(biāo)準(zhǔn)分組。
　　4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和處理。用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)得數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料的

5、組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，率的比較采用Chi—Square檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan—Meire法與COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　第二部分：PITX1對(duì)U2OS細(xì)胞株的影響
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：骨肉瘤細(xì)胞株U2OS用DMEM/F121:1（含10%胎牛血清），在37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。
　　2.以L(fǎng)ipofectamine2000為載體，將設(shè)計(jì)合成的PITX1-siRNA轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞

6、株。按轉(zhuǎn)染的不同分不同實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。
　　3. Real-Time PCR檢測(cè)U2OS細(xì)胞中各處理組PITX1、RASAL1、P53mRNA的表達(dá)情況。
　　4.蛋白免疫印跡法檢測(cè)U2OS細(xì)胞中各處理組PITX1、RASAL1、P53蛋白的表達(dá)情況。
　　5. MTT法檢測(cè)PITX1-siRNA對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PITX1-siRNA對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響。
　　7. Tra

7、nswell小室法檢測(cè)PITX1-siRNA對(duì)U2OS細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　8.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和處理。用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析的Newman-Keul's檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　第一部分：PITX1在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義
　　1．PITX1在骨肉瘤組織的表達(dá)顯著低于正常骨組織。
　　2．PITX1與骨肉瘤患者的生存期、肺轉(zhuǎn)移

8、密切相關(guān)。
　　3．PITX1高表達(dá)為骨肉瘤患者預(yù)后的有利因素。
　　第二部分：抑制PITX1對(duì)U2OS細(xì)胞株的影響
　　1．U2OS細(xì)胞中，抑制PITX1基因后，下游基因RASAL1、P53mRNA及蛋白的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)。
　　2．U2OS細(xì)胞中，抑制PITX1基因后，細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖能力增強(qiáng)，而凋亡率降低。
　　結(jié)論：
　　PITX1在骨肉瘤組織的表達(dá)顯著低于正常骨組織；PITX1表達(dá)的