miR-330下調(diào)脊髓后角GABAB2受體參與慢性胰腺炎痛敏機制的研究.pdf

1、研究目的:疼痛是90％的慢性胰腺炎患者和晚期胰腺癌患者的主要癥狀，常表現(xiàn)為反復(fù)劇烈發(fā)作且持續(xù)時間長，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。根據(jù)已有的慢性胰腺炎痛敏發(fā)生機制提出的鎮(zhèn)痛措施往往不能令患者滿意。同時，在臨床上觀察到，絕大多數(shù)胰腺癌癌痛患者存在胰腺組織的炎癥性病變。因此，明確胰腺炎疼痛的致痛機制具有重要的臨床意義。
　　microRNAs作為轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子，可通過部分同源序列與目的信使RNA(mRNA)的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA

2、的降解或翻譯的終止。關(guān)于miRNAs在疼痛機制中的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與神經(jīng)元的可塑性、神經(jīng)元的發(fā)生、傷害感受的興奮性、痛閾及慢性痛有關(guān)。前期的研究中，利用miRNAs芯片技術(shù)檢測了裸鼠胰腺癌模型脊髓背角及正常裸鼠脊髓背角miRNAs的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA330（miR-330）在癌痛發(fā)生組裸鼠脊髓背角的表達較正常裸鼠及無癌痛裸鼠顯著升高，而無癌痛裸鼠組及正常裸鼠組miR-330的表達無明顯差異。這提示miR-330可能與疼

3、痛的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。進一步利用基因數(shù)據(jù)庫檢測到miR-330的靶基因可能是表達GABAB2受體(GABAB2-R)的基因。GABAB2-R是GABAB受體的一個主要亞基，是GABAB受體發(fā)揮功能不可或缺的一部分。GABAB受體是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的主要受體之一，廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。在脊髓中，GABAB受體主要表達在脊髓背角淺層，該受體激活后可調(diào)節(jié)突觸的可塑性和興奮性，從而在疼痛的發(fā)生和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。
　　因此，

4、miR-330是否通過下調(diào)GABAB2-R的表達，抑制GABAB受體的功能，參與慢性胰腺炎痛敏的發(fā)生，是本研究的主要目的。
　　研究方法:
　　(1)鞘內(nèi)注射慢病毒溶液轉(zhuǎn)染miR-330，檢測脊髓神經(jīng)元轉(zhuǎn)染miR-330后大鼠痛行為學(xué)變化。
　　(2)利用二丁基二氯化合物(DBTC)一次性尾靜脈注射wistar雄性大鼠建立慢性胰腺炎模型。測量正常大鼠、DBTC注射后3d，7d，14d，21d大鼠腹部機械痛閾值。

5、　　(3)利用免疫組織化學(xué)法及Western-blot法檢測了GABAB2-R在慢性胰腺炎模型大鼠胸8-胸12(T8-T12)節(jié)段脊髓背角蛋白水平的表達變化。
　　(4)利用免疫熒光組織化學(xué)法及RT-PCR法檢測了GABAB-R在慢性胰腺炎模型大鼠T8-T12節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元上基因水平的表達變化。
　　(5)利用熒光素酶報告基因?qū)嶒炋接憁iR-330與GABAB2-R基

6、因的靶向關(guān)系。
　　實驗結(jié)果:
　　(1)脊髓神經(jīng)元轉(zhuǎn)染miR-330的大鼠腹部機械痛閾值較對照組大鼠顯著下降。鞘內(nèi)注射攜帶miR-330慢病毒和空載病毒后的5d、7d、14d、21d，測量大鼠的腹部機械痛。結(jié)果發(fā)現(xiàn):注射慢病毒14d以后，轉(zhuǎn)染miR-330組大鼠的腹部機械痛閾較空載病毒組明顯下降，痛閾值由50g降低到10g。
　　(2)利用DBTC一次尾靜脈注射法成功建立慢性胰腺炎模型，注射DBTC后3d，7d，14

7、d，21d大鼠腹部機械痛閾值較正常大鼠下降。胰腺HE染色發(fā)現(xiàn)，DBTC注射組大鼠7d后，胰腺散在的腺泡細胞腫脹壞死，廣泛的炎癥細胞浸潤及大量的纖維結(jié)締組織增生。測量靜脈注射DBTC后3d，7d，14d，21d大鼠及正常大鼠腹部機械痛閾值，結(jié)果發(fā)現(xiàn):DBTC注射后3d大鼠腹部機械痛閾值顯著下降，并且隨時間延長，大鼠腹部疼痛的程度逐漸加重。
　　(3)免疫組化結(jié)果提示，GABAB2-R主要表達在與傷害感受密切相關(guān)的脊髓背角淺層。

8、>　　(4)慢性胰腺炎大鼠T8-T12節(jié)段脊髓背角神經(jīng)元上GABAB2-R的表達較正常大鼠顯著下調(diào)。在建模后3d、7d、14d、21d測量腹部機械痛閾值，檢測脊髓背角GABAB2-R的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):注射DBTC3d后在胰腺炎急性期，GABAB2-R的表達與正常大鼠GABAB2-R的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，7d、14d、21d后在胰腺炎的慢性期，GABAB2-R的表達下調(diào)至正常組的1/3-1/2，并且其下調(diào)的趨勢與慢性胰腺炎大鼠痛閾值

9、下降的趨勢一致。
　　(5)免疫熒光組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn):在大鼠T8-T12節(jié)段DRG神經(jīng)元中，GABAB1-R及GABAB2-R廣泛表達。慢性胰腺炎大鼠T8-T12節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上，GABAB-R的表達較正常大鼠顯著下調(diào)。
　　(6)熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了GABAB2-R的基因是miR-330的一個作用靶點。實驗結(jié)果表明miR-330能與GABAB2-R的基因GABBR2的3'UTR結(jié)合，抑制GABAB2-R表達。