miR-330抑制脊髓神經(jīng)元的GABAB受體功能介導(dǎo)胰腺癌痛的機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNAs是一種的小內(nèi)源性非編碼核苷酸片段，約19-23個(gè)核苷酸，能夠通過翻譯抑制或靶目標(biāo)mRNA降解來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。越來越多的研究顯示miRNAs有可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和維持中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由于其特異的靶目標(biāo)屬性，一個(gè)單一的miRNA可以同時(shí)結(jié)合和調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo)基因序列。有學(xué)者提出miRNAs作為基因序列表達(dá)的總開關(guān)，對(duì)于正常機(jī)體活動(dòng)是必不可少的，一旦其功能活動(dòng)受到影響，極可能導(dǎo)致身體病理性疾病的發(fā)生。但是，miR

2、NA數(shù)量巨大，目前為止，經(jīng)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRbase)確認(rèn)的數(shù)量已經(jīng)達(dá)到1000多種，因此，其具體作用及機(jī)制還有大量的內(nèi)容等待我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。MicroRNAs參與疼痛相關(guān)神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)，成為最近幾年在疼痛研究領(lǐng)域令人關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　臨床上，胰腺癌癌痛發(fā)生率高，缺乏有效治療手段，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。本研究通過基因芯片分析首次發(fā)現(xiàn)，在有痛覺過敏的胰腺癌裸鼠模型脊髓后角miR-330表達(dá)升高，而無明顯痛覺過敏的胰腺癌模型裸鼠和正

3、常裸鼠之間，miRNA-330的表達(dá)無明顯差異，強(qiáng)烈提示其可能在胰腺癌痛發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步地，我們經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)篩查分析發(fā)現(xiàn)，中樞主要促代謝型抑制性受體GABAB的B2亞型可能是miR-330的調(diào)控作用位點(diǎn)。所以，我們?cè)谥爸赝庵苌窠?jīng)在胰腺癌痛中作用研究基礎(chǔ)上，本論文將利用原代培養(yǎng)的脊髓后角神經(jīng)元，結(jié)合基因操作、分子生物學(xué)和電生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)，重點(diǎn)關(guān)注miR-330高表達(dá)抑制脊髓后角神經(jīng)元中GABAB2受體表達(dá)及其相應(yīng)功能，

4、進(jìn)而導(dǎo)致胰腺癌痛發(fā)生的可能機(jī)制，為胰腺癌痛的機(jī)制研究和臨床治療提供新的思路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.脊髓后角miR-330高表達(dá)可能導(dǎo)致胰腺癌痛發(fā)生。
　　1)在有痛覺過敏的胰腺癌裸鼠模型脊髓后角，相比較于無明顯痛覺過敏的胰腺癌模型裸鼠和正常裸鼠，術(shù)后7天、21天miR-330mRNA表達(dá)的顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而胰腺癌裸鼠模型中無痛覺過敏組與正常裸鼠相比，miR-330的表達(dá)并未發(fā)現(xiàn)明顯改變;
　　2)在培養(yǎng)的脊髓

5、后角神經(jīng)元上，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染高表達(dá)miR-330，電生理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞興奮性升高，其自發(fā)興奮性突觸后電流(sEPSCs)的波幅和頻率都顯著上升，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予10μM baclofen處理后，能顯著抑制其波幅和頻率。說明miR-330可以通過突觸前與突觸后機(jī)制調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元活性。
　　2.miR-330抑制GABAB2受體功能的機(jī)制。
　　1)在裸鼠胰腺癌痛模型，脊髓后角GABAB2的受體術(shù)后7天、14

6、天、21天、28天表達(dá)下降，術(shù)后14天時(shí)GABAB2下降達(dá)到峰值，至術(shù)后21天，情況有所恢復(fù)。這與裸鼠7天后開始有痛覺過敏的行為學(xué)表現(xiàn)的出現(xiàn)時(shí)間相符合。
　　2)脊髓后角神經(jīng)元正常培養(yǎng)7天后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空病毒組(vehicle組)，轉(zhuǎn)染miR-330病毒組。轉(zhuǎn)染48h后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比， GABAB2受體的表達(dá)在vehicle組稍有下降，在轉(zhuǎn)染miR-330組顯著下降

7、;而與GABAB2的表達(dá)不同，培養(yǎng)7天同樣進(jìn)行miR-330慢病毒轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元中，vehicle組與轉(zhuǎn)染miR-330組GABAB1的表達(dá)下降不明顯，為(0.87±0.20)、(0.94±0.24)，與正常組比較都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　3)雙熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-330能通過與GABAB2基因的3'UTR結(jié)合，抑制GABAB2基因的表達(dá);
　　4)給予谷氨酸處理，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞膜GABAB2和GABAB1的表