核基因Tribble3調(diào)控MAPK信號(hào)通路在糖尿病腎病中的作用及控制.pdf

1、第一部分:Db/db小鼠腎臟中核基因Tribble3的表達(dá)及其與腎臟纖維化的關(guān)系
　　背景
　　糖尿病是一種全球疾病，而且其在全球范圍的增長速度非?？?。糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，還是糖尿病患者主要的致殘、致死原因，其發(fā)病率也在不斷升高。DN已成為終末期腎病(end-stagerenaldisease，ESRD)的主要原因之一?，F(xiàn)在越來越多證據(jù)表明，糖尿病腎病最終

2、會(huì)演變成腎臟纖維化，而其具體發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明。因此，深入研究探討糖尿病腎病的分子發(fā)生機(jī)制，為延緩糖尿病腎病發(fā)展進(jìn)程提供新的科學(xué)理論依據(jù)是具有長遠(yuǎn)意義的。
　　DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生與發(fā)展包括多種因素:高血糖、高血脂、高血壓以及蛋白尿等。高血糖(Hyperglycemia)作為糖尿病的基本臨床癥狀，是引起糖尿病諸多并發(fā)癥的主要原因，同樣也是DN的主要致病因素。高血糖能夠刺激腎臟固有細(xì)胞和非固有細(xì)胞分泌產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因

3、子造成腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，這是目前一致認(rèn)可DN發(fā)病機(jī)制。
　　Tribbles基因是2000年在果蠅體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白激酶，它是一種核基因，可以抑制細(xì)胞有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Tribbles基因作為一個(gè)“腳手架蛋白”(scaffoldproteins)，可以在多條信號(hào)通路上發(fā)揮重要作用。其家族成員TRB3定位于人類染色體20p13-p12.2，而2型糖尿病的相關(guān)基因也定位于此位置，提示TRB3與糖尿病有著天然的聯(lián)

4、系。TRB3可以參與多種細(xì)胞的增殖分化調(diào)節(jié)，在肝臟、脾臟、胰腺、胸腺、心臟和腎臟中均有表達(dá)。Du等發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比，在db/db小鼠的肝臟中TRB3的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高，TRB3表達(dá)量的升高促進(jìn)了血糖及糖耐量升高。劉進(jìn)穩(wěn)等研究發(fā)現(xiàn)TRB3的表達(dá)量與通過結(jié)扎單側(cè)輸尿管建立的纖維化模型腎臟組織的纖維化程度呈正相關(guān)，由此看出，TRB3不僅與血糖調(diào)節(jié)相關(guān)，而且可能參與了纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。然而，我們并未看到關(guān)于TRB3是否參與了糖

5、尿病腎病的腎臟纖維化發(fā)展的相關(guān)研究。
　　目的
　　1.探討TRB3在db/db小鼠腎臟中的表達(dá);
　　2.探討TRB3與db/db小鼠腎臟TGF-β1的表達(dá)及其與纖維化程度的相關(guān)性。
　　方法
　　12周齡雄性C57BL/KSJ背景2型糖尿病腎病db/db小鼠15只及同周齡db/m小鼠15只，其中db/db小鼠為糖尿病腎病模型組（DN組），db/m小鼠為正常對(duì)照組（C組），所有動(dòng)物均標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程

6、中進(jìn)行下列指標(biāo)監(jiān)測:(1)每周監(jiān)測隨機(jī)血糖1次。(2)兩組小鼠分別在16、20、25周齡取材，取材前1d，收集各小鼠24h尿液，測定尿蛋白濃度并計(jì)算24h尿蛋白量(UAE)。(3)取材前將所有小鼠禁食12h并稱其體質(zhì)量(BW)，心臟取血進(jìn)行血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)檢測。(4)通過蘇木精-伊紅(HE)染色、高碘酸-無色品紅(PAS)染色、馬松三色(Masson)染色觀察腎組織病理改變，并計(jì)算腎小球系膜基質(zhì)相對(duì)面積和間質(zhì)纖維化程度

7、。(5)免疫組化法檢測TRB3蛋白在小鼠腎組織中的表達(dá)。(6)RT-PCR、Westernblotting分別檢測TRB3、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA及蛋白水平的變化。
　　結(jié)果
　　1.生化指標(biāo)
　　C組隨機(jī)血糖保持平穩(wěn)，而DN組血糖升高趨勢明顯，且在16周時(shí)兩組血糖差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與同周齡C相比，DN的UAE、Scr和BUN均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2

8、.腎組織病理
　　兩組小鼠均未發(fā)現(xiàn)典型糖尿病腎病的K-W結(jié)節(jié)性表現(xiàn)及明顯的間質(zhì)纖維化。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)C組小鼠腎小球及系膜區(qū)均未見明顯異常改變及PAS陽性物質(zhì);DN組可見毛細(xì)血管壁和系膜區(qū)PAS染色陽性，腎小球肥大，毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬。兩組小鼠腎小球系膜及基底膜相對(duì)面積在20、25周齡時(shí)有顯著差異（P＜0.01），腎間質(zhì)纖維組織相對(duì)面積在16、20、25周齡時(shí)有顯著差異（P＜0.01）。
　　3.免疫組織

9、化學(xué)染色檢測TRB3
　　結(jié)果顯示TRB3在兩組小鼠的腎臟組織中都有表達(dá)，且表達(dá)于腎小球固有細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡Westernblotting檢測
　　與C組相比，20、25周DN組TRB3、TGF-β1mRNA顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，20周TRB3蛋白，25周TRB3、TGF-β1蛋白水平均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，且均隨病程進(jìn)展呈上升趨勢。<

10、br>　　5.相關(guān)性分析
　　DN組TRB3蛋白表達(dá)與TGF-β1表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.944，P＜0.01)，并且與腎間質(zhì)纖維化程度具有正相關(guān)性（r=0.857，P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　1.Db/db鼠，在Leptin受體基因上存在G→T點(diǎn)突變，腎小球肥大、蛋白尿及腎小球硬化等腎臟畸形在db/db鼠上的表現(xiàn)非常顯著，與人類糖尿病腎病具有明顯相似性。
　　2.腎小球肥大，毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)增寬

11、，PAS染色陽性是糖尿病腎病的主要病理改變。
　　3.TRB3在小鼠腎臟組織中有表達(dá)。
　　4.與同周齡db/m小鼠相比，TRB3在db/db小鼠腎臟組織中表達(dá)量升高，且與TGF-β1的表達(dá)量及間質(zhì)纖維化程度存在明顯正相關(guān)，提示TRB3可能參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第二部分:Tribble3在高糖對(duì)小鼠腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)蛋白合成的影響中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　背景
　　許多研究已經(jīng)證

12、實(shí)，腎小球硬化和間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病(DN)的主要病理特征[1]，尤其是在DN發(fā)展的中后期。其中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積是導(dǎo)致腎小球硬化的主要病理改變，如由TGF-β1調(diào)節(jié)的多種膠原蛋白、纖連蛋白(FN)的積聚[2]。DN的發(fā)病中，在ECM的沉積與系膜膨脹過程中腎小球系膜細(xì)胞起重要作用[3]，TGF-β1是ECM合成的核心細(xì)胞因子，它對(duì)于糖尿病條件下系膜的纖維化與肥大有重要作用[4]。大量研究顯示，ECM的主要成分是Ⅰ-Ⅳ型膠原蛋

13、白及其一系列代謝產(chǎn)物[5]。
　　MAPKs是脊椎動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白調(diào)節(jié)激酶，MAPK鏈?zhǔn)钦婧松镄盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，此信號(hào)通路在基因表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAPK含有三個(gè)經(jīng)典的亞家族途徑，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)，P38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)。有研究結(jié)果顯示p38MAPK和JNK在糖尿病腎病的腎臟組織中活性均顯著增強(qiáng)[6,7]，這表明MAPK信號(hào)通路與DN是密

14、切相關(guān)的。
　　假性激酶Tribble3(TRB3)可以控制細(xì)胞應(yīng)激和生長及代謝，與胰島素抵抗的發(fā)生具有相關(guān)性。最新研究發(fā)現(xiàn)TRB3可與TGF-β1的下游信號(hào)因子Smad3相互作用，增強(qiáng)TGF-β1信號(hào)通路的活性，可能在纖維化的進(jìn)展中以誘導(dǎo)上皮-間葉轉(zhuǎn)化的方式發(fā)揮促進(jìn)作用，而且早已有臨床研究證實(shí)TRB3R84變構(gòu)體與2型糖尿病引發(fā)的慢性腎病有關(guān)[8,9]。MAPK鏈作為真核生物基礎(chǔ)的信號(hào)通路與其他諸多通路存在廣泛的交互作用，許多信

15、號(hào)通路最終都要和MAPK通路發(fā)生“cross-talk”。Trbs作為調(diào)節(jié)MAPK活性的關(guān)鍵因子以及MAPK信號(hào)通路在DN發(fā)病中的重要作用為trb3可能參與DN發(fā)病提供了有力的理論依據(jù)。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中我們得出結(jié)論TRB3在db/db小鼠的腎臟組織中表達(dá)量升高，且與纖維化因子TGF-β1的表達(dá)量及間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)，此結(jié)果提示我們核基因TRB3可能在糖尿病腎臟纖維化的發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。此外，最近有研究表明TRB3是MA

16、PKs活性的重要調(diào)節(jié)因子。Kiss-Toth等發(fā)現(xiàn)TRBs對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的連鎖反應(yīng)具有廣泛和特異的調(diào)控作用[10-12]，在MAPK、PI3K/AKT、PPAR等多條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控中位于“bottlenecks”的關(guān)鍵位置。
　　據(jù)此，我們提出TRB3可通過對(duì)MAPK信號(hào)途徑活性的調(diào)節(jié)繼而直接參與DN發(fā)病或間接地通過調(diào)控TGF-β1活性參與DN發(fā)病的重要機(jī)制的假設(shè)。
　　目的
　　利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步

17、探討糖尿病腎病中TRB3對(duì)ERK1/2-MAPK和TGF-β1/Smad兩條信號(hào)通路活性的調(diào)控作用，以及對(duì)糖尿病腎病腎臟纖維化因子TGF-β1和Ⅳ型膠原蛋白合成的影響。
　　方法
　　本研究以永生化小鼠腎小球系膜細(xì)胞SV40MES13（MMCs）為研究對(duì)象。采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)，蛋白免疫印跡(westernblotting)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等實(shí)驗(yàn)方法，分別做以下試驗(yàn)觀察:
　　1.按照

18、培養(yǎng)環(huán)境不同將細(xì)胞大體分為低糖組、高滲組、高糖組，即分別給予葡萄糖（5.5mmol/L）、甘露醇（25mmol/L）、葡萄糖（25mmol/L）孵育MMCs，檢測TGF-β1、TRB3、collagentypeⅣ(Col-Ⅳ)mRNA及蛋白含量;
　　2.低糖、高滲、高糖環(huán)境刺激MMCs一定時(shí)間后，觀察ERK1/2-MAPK信號(hào)通路活性的變化;
　　3.設(shè)計(jì)、化學(xué)合成TRB3小干擾RNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MMCs抑制TRB3表

19、達(dá)后，觀察高糖刺激對(duì)ERK1/2-MAPK磷酸化水平及細(xì)胞合成TGF-β1、Col-Ⅳ的mRNA、蛋白含量的變化;
　　4.給予ERK1/2-MAPK特異性通路阻斷劑PD98059后，高糖對(duì)MMCs合成TGF-β1、Col-Ⅳ、TRB3的影響。
　　結(jié)果
　　1.分別以低糖、高滲、高糖條件孵育MMCs0h、6h、12h、24h、48h。48h內(nèi)，高糖時(shí)間依賴性刺激MMCsTRB3、TGF-β1、Col-ⅣmRNA及蛋白

20、質(zhì)合成，mRNA合成量在12h達(dá)到峰值，蛋白合成量在48h達(dá)到峰值（P＜0.01），而高滲組無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　2.高糖刺激24h以內(nèi)，ERK1/2磷酸化水平呈時(shí)間依賴性升高，在24h時(shí)達(dá)到峰值水平（P＜0.01）;
　　3.篩選最佳抑制效果TRB3小干擾RNA抑制TRB3表達(dá)后，高糖刺激MMCs12h，TGF-β1、Col-ⅣmRNA顯著下降(P＜0.01)，高糖刺激MMCs24h，TGF-β1、Col-Ⅳ

21、蛋白顯著下降(P＜0.01);
　　4.PD98059可抑制高糖引起的TGF-β1、Col-ⅣmRNA及蛋白下降(P＜0.01)，但TRB3蛋白表達(dá)確明顯升高（P＜0.01）。
　　結(jié)論
　　1.高糖通過ERK1/2-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞因子TGF-β1、Col-Ⅳ的合成;
　　2.高糖是TRB3的刺激因子之一，TRB3通過ERK1/2-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與TGF-β1、Col-Ⅳ的合成代謝;