驅(qū)動蛋白KIF4對胃癌細胞BGC增殖和卵巢癌細胞SK-OV-3遷移的影響.pdf

1、研究目的：
　　 研究驅(qū)動蛋白KIF4在胃癌組織的表達情況及對胃癌細胞BGC增殖的影響。同時研究KIF4對卵巢癌細胞SK-OV-3遷移的影響。為闡明KIF4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)，同時也為探索新的腫瘤生物治療方法提供幫助
　　 一、驅(qū)動蛋白KIF4在胃癌組織中的表達情況
　　 1、免疫組織化學染色實驗比較KIF4在胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達情況
　　 本研究中23例原發(fā)性胃癌病人于2006-2

2、008年間在山東大學齊魯醫(yī)院接受外科手術(shù)，手術(shù)之后，腫瘤樣本和它相應(yīng)的癌旁組織用石蠟包埋，室溫儲存。石蠟包埋的標本組織被切成4-5um，放置至載玻片上。羊血清封閉后，抗KIF4的多克隆抗體以1:500稀釋，加至載玻片上。免疫染色用晶美生物技術(shù)公司的Histostain-Plus試劑盒，過程參照說明書。陰性對照用PBS溶液代替一抗。每張標本用奧林帕斯IX81倒置顯微鏡隨機拍取5張照片。照片的累積光密度用Image-Pro Plus6.0軟

3、件進行分析。
　　 2、統(tǒng)計分析KIF4的表達量與臨床資料的相關(guān)性
　　 用SPSSll.0進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析。每一個實驗的結(jié)果用平均值±標準差來描述。用雙側(cè)t檢驗來比較實驗組和對照組。用列聯(lián)表來分析KIF4的表達與胃癌病人的病理學變量的關(guān)系。
　　 二、驅(qū)動蛋白KIF4對胃癌細胞BGC增殖的影響
　　 1、篩選穩(wěn)定表達GFP-KIF4的BGC細胞株(BGC-GFP-KIF4)及穩(wěn)定表達GFP的BGC細胞

4、株(BGC-GFP)
　　 2、免疫熒光染色顯示過表達KIF4引起的細胞多核性
　　 生長在蓋玻片上的穩(wěn)篩細胞株用冷甲醇室溫固定5min，然后用含5％羊血清、0.3％TritonX-100的PBS封閉。一抗用鼠抗Tubulin的抗體（1：10000稀釋），二抗用TexasRed交聯(lián)的羊抗鼠的抗體（1:10000稀釋），分別染色2h。DNA用DAPI(1ug/ml)染色5min。PBS洗后，用FluoroGuard抗淬滅劑

5、將蓋玻片固定在干凈的載玻片上，指甲油封邊。
　　 3、細胞增殖計數(shù)及MTT檢測過表達KIF4對BGC增殖的影響
　　 將兩種穩(wěn)篩細胞株接種于24孔板中，每孔500u1細胞懸液中含5000個細胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接下來的9天內(nèi)，每隔一天計數(shù)細胞數(shù)量。根據(jù)數(shù)據(jù)給制細胞生長曲線。
　　 將兩種穩(wěn)篩細胞株接種于96孔板中，每孔200u1細胞懸液中含5000個細胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接下來的9天內(nèi)，每隔一天采用MTT法檢

6、測細胞增殖情況。每孔加入20ul5mg/mlMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時。然后去除細胞培養(yǎng)基，加入20.0ulDMSO，20min后，在酶標儀上570nm測量吸光度值。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制曲線。
　　 4、克隆形成實驗檢測過表達KIF4對BGC增殖的影響
　　 在35mm平皿中鋪入2ml含0.6％瓊脂的培養(yǎng)基，室溫下凝固作為下層膠。1×104個細胞加入lml含0.3％瓊脂的培養(yǎng)基中，作為上層膠。培養(yǎng)3周后，用0.05％結(jié)晶紫染色細胞

7、30min。拍攝照片并用Image-Pro Plus6.0進行克隆計數(shù)。
　　 5、裸鼠體內(nèi)成瘤檢測過表達KIF4對BGC成瘤性的影響
　　 實驗用的雌性BABL/c小鼠（6-8周大）從中國科學院上海實驗動物中心購進。取4x106個BGC-GFP-KIF4或BGC-GFP細胞和100 gMatrigel接種到無胸腺小鼠(nu/nu)的左腋下。每組5只。腫瘤的大小每周用游標卡尺進行測量。腫瘤的體積通過下列公式計算：體積=（

8、長×寬2）/2。7周后，脫頸法處死小鼠，從小鼠體內(nèi)取出腫瘤組織測量體積和稱重并照相。
　　 6、統(tǒng)計分析
　　 使用SPSSI6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對正態(tài)分布的配對數(shù)據(jù)進行，檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 三、驅(qū)動蛋白KIF4對卵巢癌SK-OV-3遷移能力的影響
　　 1.篩選穩(wěn)定低表達KIF4的SK-OV-3細胞株
　　 2、低表達KIF4對卵巢癌細胞SK-OV-3遷移能力的影

9、響
　　 使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對正態(tài)分布的配對數(shù)據(jù)進行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 一、驅(qū)動蛋白KIF4在胃癌組織中的表達情況
　　 1、驅(qū)動蛋白KIF4在胃癌中表達降低
　　 免疫組織化學檢測了23例胃癌樣本及相應(yīng)的癌旁組織。KIF4的表達水平根據(jù)免疫組化染色實驗分成8級。結(jié)果顯示，23例中有13(56.5％)例呈現(xiàn)癌組織比癌旁組織低表達。應(yīng)用Image-Pro P

10、lus6.0軟件，測量樣本KIF4染色的累積光密度，發(fā)現(xiàn)所有癌旁組織的累積光密度比癌組織要高4倍。
　　 2、KIF4在胃癌組織中表達降低與胃癌分化有相關(guān)性
　　 我們接下來研究KIF4的表達和臨床病理特征，臨床檔案資料之間的聯(lián)系。結(jié)果顯示KIF4的低表達和胃癌的低分化之間有顯著相關(guān)性。在19例低分化的胃癌中，13例呈現(xiàn)出KIF4在癌組織中較癌旁組織中低表達。但是，4例中分化的腫瘤樣本中，沒有一例癌組織比癌旁組織KIF4

11、低表達。所有結(jié)果表明，驅(qū)動蛋白KIF4在胃癌組織中低表達，且表達程度與腫瘤分化級別密切相關(guān)。
　　 二、驅(qū)動蛋白KIF4對胃癌細胞BGC增殖的影響
　　 1、成功篩選穩(wěn)定表達GFP-KIF4的BGC細胞株(BGC-GFP-KIF4)及穩(wěn)定表達GFP的BGC細胞株(BGC-GFP)
　　 2、免疫熒光染色顯示過表達KIF4引起細胞多核性
　　 在BGC-GFP-KIF4細胞中存在比BGC-GFP細胞中更多的

12、多核細胞。在BGC-GFP-KIF4細胞中有14.54±0.82％的多核細胞，而在BGC-GFP中只有4.44±0.46％，與BGC細胞中相似。
　　 3、細胞增殖計數(shù)及MTT表明過表達KIF4對BGC增殖有抑制作用
　　 細胞增殖計數(shù)及MTT每隔一天檢測一次，一共持續(xù)9天。結(jié)果顯示，前3天內(nèi)，兩株細胞間沒有顯著的差別。但是從第5天開始，BGC-GFP-KIF4相對于BGC-GFP和BGC細胞來說，增殖顯著抑制。而在BG

13、C-GFP和BGC之間沒有增殖效率的不同，說明在BGC細胞表達GFP不會影響細胞的增殖。
　　 4、克隆形成實驗表明過表達KIF4對BGC增殖有抑制作用
　　 為了檢驗細胞在不貼壁情況下的生存能力，利用軟瓊脂克隆形成實驗來檢測兩種細胞系。1x104個細胞種植在35mm的軟瓊脂培養(yǎng)基中。3周后，細胞用結(jié)晶紫染色后拍照。計數(shù)細胞克隆。在BGC-GFP中有平均143±9個細胞克隆，而在BGC-GFP-KIF4中只有30±9個細

14、胞克隆。這些結(jié)果說明在細胞不貼壁的情況下，當在BGC中過表達KIF4，細胞增殖被顯著抑制。
　　 5、裸鼠體內(nèi)成瘤表明過表達KIF4對BGC成瘤性的抑制作用
　　 4x106個BGC-GFP-KIF4或BGC-GFP細胞接種到無胸腺裸鼠的左腋下（每組5只），每周測量記錄腫瘤大小，測量7周。由BGC-GFP-KIF4衍生出的腫瘤比BGC-GFP衍生出的生長緩慢很多。7周后，所有小鼠處死，分離腫瘤。然后將腫瘤樣本稱重并拍照。

15、BG-GFP-KIF4生長出的腫瘤的平均重量(0.9±0.24g)顯著低于BGC-GFP生長出的腫瘤(3.0-1.17g)，大約要輕3倍。這些結(jié)果都表明，BGC-GFP-KIF4在裸鼠形成腫瘤的能力相對于BGC-GFP來說要弱很多。表明在BGC細胞過表達KIF4可抑制體內(nèi)腫瘤的形成。
　　 三、驅(qū)動蛋白KIF4對卵巢癌SK-OV-3遷移能力的影響
　　 1、篩選穩(wěn)定低表達KIF4的SK-OV-3細胞株
　　 2、

16、細胞遷移實驗
　　 SK-OV-3組、NC對照組、KIF4敲除組l、KIF4敲除組2下室面細胞平均數(shù)分別為122、112、298、312。KIF4敲除組遷移到下室面的細胞數(shù)明顯多于SK-OV-3組和NC對照組，可達大約3倍。
　　 結(jié)論及意義：
　　 1.本研究成功構(gòu)建了一個過表達質(zhì)粒pEGFP-KIF4和兩個敲除質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-KIF4及pGPU6/GFP/Neo-NC，三種載體的構(gòu)建為進一步研

17、究KIF4的功能提供了必要的條件。
　　 2.本研究表明驅(qū)動蛋白KIF4在胃癌中表達降低，且與胃癌分化有相關(guān)性。為胃癌發(fā)病機制的研究奠定了基礎(chǔ)，也為下一步的細胞水平實驗指明了方向。
　　 3.本研究證明在胃癌細胞BGC中過表達KIF4可抑制BGC的增殖和體內(nèi)成瘤，為進一步深入研究KIF4功能奠定了基礎(chǔ)，同時也為發(fā)現(xiàn)胃癌治療新靶點提供實驗依據(jù)。
　　 4.本研究證明在SK-OV-3中低表達KIF4可使細胞遷移能力增