糖皮質(zhì)激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特點(diǎn)之一，也是造成腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，包括腫瘤細(xì)胞從原位腫瘤脫落，脫落的腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)黏附、釋放基質(zhì)水解酶破壞和穿過基底膜，侵襲血管和淋巴管，進(jìn)入循環(huán)并最終達(dá)到轉(zhuǎn)移部位，在新的部位定居并增殖。細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力是決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的重要因素。腫瘤的遷移涉及細(xì)胞骨架和形態(tài)的改變、細(xì)胞的粘附和運(yùn)動(dòng)，期間參與調(diào)控的有多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子、與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的小G蛋白（如小G

2、蛋白R(shí)ho亞家族的成員RhoA，RhoB和RhoC），骨架調(diào)節(jié)蛋白和趨化因子等。而腫瘤細(xì)胞的侵襲能力除了與其增殖和運(yùn)動(dòng)遷移能力有關(guān)外，還與其降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，如分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)以及一些蛋白酶的激活物，如尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)等有關(guān)。近年來的研究已證明腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力還依賴于腫瘤的微環(huán)境。由于腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，參與調(diào)控的因素很多，其機(jī)制目前仍不很清楚。
　　最新的臨床資料研究，流行病學(xué)研究和動(dòng)物模型

3、為基礎(chǔ)的研究均提示慢性應(yīng)激影響腫瘤的進(jìn)展，因此由于應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌改變對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響近年來很受關(guān)注。已有一些研究表明交感和腎上腺素系統(tǒng)直接有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的作用。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是體內(nèi)另一個(gè)重要應(yīng)激激素，在軀體和心理應(yīng)激時(shí)血漿中GC明顯增高。此外，人工合成的GC，如地塞米松(Dex)被臨床廣泛用于治療免疫與炎癥性疾?。ㄈ缂t斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎），以及作為重要的輔助藥物用于減輕因腫瘤化療治療

4、帶來的不良反應(yīng)（如過敏，惡心嘔吐等），這些也可導(dǎo)致體內(nèi)GC水平的增高。GC的作用通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)介導(dǎo)。作為激素依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，激活的GR以二聚體的形式與靶基因啟動(dòng)子中的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response element，GRE)結(jié)合，直接地調(diào)節(jié)（促進(jìn)或者抑制）基因表達(dá)，或者通過與其他轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB和AP-1等）相互作用而間接地調(diào)節(jié)基因表達(dá)

5、，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。近年來的國(guó)外和我們的研究都表明GC還可影響細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子的表達(dá)和活性，并在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為GC對(duì)實(shí)體腫瘤的作用主要通過其對(duì)免疫系統(tǒng)的作用，即通過其強(qiáng)大的免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。迄今GC對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的研究十分有限，而且已報(bào)道的結(jié)果因腫瘤細(xì)胞的類型以及所用的腫瘤模型不同而各異，既有促進(jìn)作用，也有抑制作用，至今不明確，其作用機(jī)制也不清楚，因

6、此這方面有進(jìn)一步研究的必要。
　　卵巢癌是婦科致死率最高的腫瘤。大于70％的卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)就已是晚期，伴有盆腹腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但目前對(duì)于卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制還不清楚，因此研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移十分必要。已有的研究表明卵巢癌組織中GR的陽(yáng)性率高達(dá)88％，比ER和PR都高，表明GC/GR信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用。國(guó)外和我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)GC能輕度抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，改變多種與細(xì)胞存活和

7、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路促進(jìn)化療藥作用下卵巢癌細(xì)胞的存活。有研究表明遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中GR的靶基因糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)高表達(dá)，且高表達(dá)的GILZ能激活PI3K/AKT的通路，促進(jìn)卵巢癌的增殖和侵襲，這強(qiáng)烈提示GC與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。既往的研究也證實(shí)作為應(yīng)激激素之一的GC對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲有促進(jìn)也有抑制作用。是否與卵巢癌細(xì)胞的來源和侵襲性的不同而有差異還不很清楚，有進(jìn)一步研究的必要。因此本課題研究了GC在體外和體

8、內(nèi)對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了GC促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制。
　　方法:
　　我們?cè)诼殉舶〩O-8910、SKOV3和A2780細(xì)胞中進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，100nMDex（人工合成的GC）處理細(xì)胞，用含10％去激素血清的培養(yǎng)基以去除血清中的激素對(duì)細(xì)胞的影響。羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色肌動(dòng)蛋白(actin)，共聚焦顯微鏡拍照。Transwell小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的垂直和水平遷移能力。預(yù)包被M

9、atrigel膠的Transwell小室（侵襲小室）檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力。Rho-GTP pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RhoB和RhoC的活性。Western Blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)和蛋白的磷酸化水平。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)抑制目的基因的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面整合素的分布。ELISA方法檢測(cè)纖連蛋白(FN)的分泌。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們采用BABL/c裸鼠腹腔注射卵巢癌細(xì)胞制備轉(zhuǎn)移瘤模型。飲水

10、中給予皮質(zhì)酮（小鼠體內(nèi)的GC）升高裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平。放射免疫方法檢測(cè)裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平。HE染色確定轉(zhuǎn)移灶的病理性質(zhì)。嘌呤霉素篩選法篩選穩(wěn)定干擾RhoB的卵巢癌細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬〨C在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　1、人工合成的GC-地塞米松(Dex)在體外能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生纖維樣改變，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重組（應(yīng)力纖維增多），增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。

11、>　　2、在BABL/c裸鼠腹腔注射卵巢癌細(xì)胞制備的轉(zhuǎn)移瘤模型中，給予皮質(zhì)酮（小鼠體內(nèi)的GC）飲水(50mg/L)能明顯升高裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平，并在體內(nèi)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞腹腔和肝臟轉(zhuǎn)移。
　　（二）GC能影響多種轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)和/或活性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　1、糖皮質(zhì)激素受體(GR)拮抗劑RU486能完全阻斷Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移促進(jìn)作用，表明Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的促遷移作用通過GR介導(dǎo)。

12、　　2、Dex能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞表達(dá)和分泌重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分-纖連蛋白(FN)，并能增加細(xì)胞粘附分子整合素β1和α5（FN的受體）在卵巢癌細(xì)胞表面的分布，用FN siRNA干擾FN的表達(dá)能明顯抑制Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。
　　3、Dex能激活PI3K/AKT信號(hào)通路，其激活最早的時(shí)間點(diǎn)在12小時(shí)，表明激活PI3K/AKT信號(hào)通路不是Dex的直接作用，F(xiàn)N siRNA干擾FN的表達(dá)能明顯抑制PI3K/AKT信

13、號(hào)通路的激活，提示整合素α5β1和FN結(jié)合導(dǎo)致的細(xì)胞粘附增強(qiáng)可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)。用PI3K/AKT通路的抑制劑wortmanin能完全阻斷Dex誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞骨架重組和Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲的促進(jìn)作用，表明PI3K/AKT通路的激活在Dex促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用中十分重要。
　　4、小G蛋白R(shí)ho亞家族（RhoA，RhoB和RhoC）是重要的細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)的調(diào)控蛋白，與GTP結(jié)合是它們的活性形

14、式。我們發(fā)現(xiàn)Dex能激活RhoB和RhoC，Dex還能增加Rho下游的ROCK2蛋白的磷酸化水平，激活ROCK2。ROCK2的特異抑制劑Fasudil抑制ROCK2的活性后能明顯抑制Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲的促進(jìn)作用。
　　5、鑒于RhoA和RhoC促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用已經(jīng)十分明確，而RhoB在細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不清楚，因此我們重點(diǎn)研究了Dex激活RhoB在其促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞黏附、遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中可能的作用。體外

15、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用RhoB siRNA干擾RhoB表達(dá)能抑制Dex促進(jìn)FN分泌以及激活PI3K/AKT信號(hào)通路的作用。更為重要的是，干擾RhoB的表達(dá)在體外能顯著抑制Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲的促進(jìn)作用，在體內(nèi)也能明顯抑制皮質(zhì)酮促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的作用。
　　6、Dex還能上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP3和MMP7的表達(dá)。用BB-94抑制MMPs的活性能明顯阻斷Dex對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:

16、　　GC在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，該作用通過GR介導(dǎo)。GC能通過促進(jìn)FN/integrin介導(dǎo)的粘附激活PI3K/AKT信號(hào)通路，并能激活RhoC/ROCK2信號(hào)通路，在GC促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。GC還能通過上調(diào)和激活小G蛋白R(shí)hoB促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移，該作用與其促進(jìn)FN分泌，增加細(xì)胞黏附進(jìn)而激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。此外GC上調(diào)的MMP3和MMP7表達(dá)也與GC促進(jìn)卵