創(chuàng)傷應激對大鼠Walker-256移植瘤生長及增殖活性的影響研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 外科手術切除腫瘤病灶是許多惡性腫瘤患者的重要治療手段，對于延長患者生存期、改善預后具有決定性的意義。腫瘤的外科手術治療大致可分為兩大類，一類為根治性切除手術，另一類則為姑息性手術。外科手術對于機體而言是一種強烈的創(chuàng)傷應激，可使機體發(fā)生許多反應，如神經(jīng)內分泌反應、細胞因子變化、代謝變化以及其他一些可能的生物學反應。這些反應在機體內本身又存在復雜而又緊密的聯(lián)系，最終使機體內部環(huán)境發(fā)生變化。腫瘤的形成和進展不單

2、只與腫瘤細胞本身有關，還與其所處的生長環(huán)境密切相關，由此產(chǎn)生腫瘤微環(huán)境的概念，即腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中所處的由腫瘤細胞、微血管、微淋巴管、眾多細胞因子、組織液及少量浸潤細胞等共同構成的內環(huán)境。腫瘤生長的微環(huán)境對于腫瘤細胞的增殖、轉移及血管生成具有重要意義，當腫瘤微環(huán)境被改變時，腫瘤生長也會受到影響。機體在創(chuàng)傷應激后產(chǎn)生一系列生物學反應，致使機體內穩(wěn)態(tài)破壞，從而可能影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。當外科手術不能根治性切除腫瘤或僅為姑息性手術時，機體

3、的創(chuàng)傷應激反應和內環(huán)境的改變便可能影響體內殘余腫瘤細胞的生長，從而利于殘余腫瘤的生長或擴散。在這種情況下是否會使患者預后更差，臨床上缺乏長期觀察。有研究稱外科打擊后內源性糖皮質激素誘導胸腺細胞凋亡和自然殺傷細胞活性的減弱可促進腫瘤發(fā)生轉移，將術后腫瘤加速生長的原因主要歸結于基礎免疫能力的減弱，這種觀點說服力有限，有待進一步研究。已有實驗證明外科打擊可能促進腫瘤發(fā)生轉移，慢性應激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦起重要作用，而急性創(chuàng)傷應激對腫瘤的生長影

4、響的研究并不深入。結合許多腫瘤需要手術治療這一客觀情況，研究創(chuàng)傷應激下腫瘤的生長和增殖活性的變化，對于提高腫瘤的防治水平具有重要意義，同時可加深外科醫(yī)生對于腫瘤切除手術的理解，為患者提供更合理的治療方式。
　　 燒傷是一種典型的創(chuàng)傷應激，燒傷和手術創(chuàng)傷對機體所造成的應激反應及炎性細胞因子的釋放有很多相似之處，且燒傷在實驗條件下更容易獲得，可控性強，可以通過改變燒傷的面積和程度來控制創(chuàng)傷的大小和程度，故選擇燒傷作為外界對機體的創(chuàng)傷

5、應激。本實驗所選Walker-256細胞是瘤株來自大鼠乳腺的一種自發(fā)性癌肉瘤，侵襲性強，Wistar大鼠對其免疫排斥弱，移植后能在Wistar大鼠體內較好地生長，是制作移植瘤模型的常用腫瘤細胞株，同時Wistar大鼠亦是制作腫瘤移植模型的常用動物，且能較好的承受燒傷打擊，是燒傷實驗常用的動物之一。實驗選取腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內皮生長因子(VEGF)、增殖細胞核抗原(PCNA)等為研究效應觀察指標。TNF-α是主要用來反映創(chuàng)

6、傷嚴重程度的觀察指標，血清中TNF-α水平的高低與創(chuàng)傷程度密切相關，可用來觀察燒傷造成的創(chuàng)傷程度。VEGF是參與腫瘤組織血管生成的重要因子，不僅參與腫瘤血管發(fā)生、增殖，還與腫瘤的浸潤、轉移有關，可用來反映腫瘤細胞的增殖活性和預后。本實驗不僅檢測大鼠血清VEGF水平，還用免疫組化法檢測腫瘤組織中VEGF的表達，以使實驗結果更具說服性。PCNA是能反映細胞增殖活性的一種標志物，對細胞由G1期向S期的過渡起調節(jié)作用，其含量的變化與細胞增殖的進

7、程同步，目前已把它作為衡量細胞增殖狀態(tài)的一個客觀指標。聯(lián)合檢測VEGF和PCNA的表達可作為評價腫瘤增殖活性和預后的可靠參考指標。研究目的是通過燒傷來造成創(chuàng)傷應激，觀察創(chuàng)傷應激后一段時間內移植瘤的重量、大鼠血清TNF-α、VEGF水平變化及腫瘤組織免疫組化染色VEGF、PCNA表達情況，通過對實驗結果進行分析，評估創(chuàng)傷應激對大鼠移植腫瘤生長和增殖活性的影響，并探討其機制。
　　 方法：
　　 1、大鼠皮下Walker-2

8、56移植瘤模型的制作:Walker-256癌細胞復蘇培養(yǎng)、傳代至對數(shù)期，取1ml注入Wistar幼大鼠腹腔傳代培養(yǎng)。1周后抽取癌性腹水，離心棄上清，取下層黏稠細胞懸液，PBS液配制成（細胞計數(shù)大于1×109/ml）乳白色含瘤懸液。取0.15ml接種于120g左右Wistar大鼠腹股溝皮下，共接種45只。3-5天后可觸及直徑約0.5cm左右皮下腫瘤結節(jié)，說明移植瘤模型制作成功。
　　 2、接種后第5天后取36只接種腫瘤成功的大鼠（

9、部分接種失敗不予入組）完全隨機分成3組(n=12):A組（對照組）僅背部去毛，不予燒傷處理;B組（輕度燒傷組）背部去毛并予100℃開水燙傷5s，燒傷面積3×3cm;C組（重度燒傷組）背部予100℃開水燙傷10s，燒傷面積4×4cm。具體操作在麻醉狀態(tài)下進行，燙傷后觀察至大鼠蘇醒后分籠飼養(yǎng)，并提供充足食物和水。
　　 3、燒傷后第10天處死三組所有大鼠，心臟取血，離心，取上層血清。血清VEGF、TNF-α定量試劑盒測定血清VEGF

10、、TNF-α濃度，檢測方法參照試劑盒測試說明書進行。取血后沿腫瘤包膜完整分離皮下腫瘤組織，測其重量，置于福爾馬林液中保存。
　　 4、分離的腫瘤組織常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，免疫組化法檢測腫瘤組織血管內皮生長因子(VEGF)及PCNA表達:采用SABC法，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。VEGF陽性判定為腫瘤細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色，定義VEGF陽性表達細胞數(shù)＜10％為(-)，≥10％為(+)，記錄各組腫瘤組織VEGF陽性

11、和陰性例數(shù)。細胞PCNA陽性染色表現(xiàn)為僅限于細胞核內，呈棕黃色顆?；驈浡苑植?，計數(shù)每個視野中的PCNA陽性細胞數(shù)和計數(shù)細胞總數(shù)，以PCNA陽性細胞數(shù)的百分率代表增殖指數(shù)并記錄。
　　 5、統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，腫瘤質量、血清TNF-α、血清VEGF、腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)的比較采用單因素方差分析(OnewayANOVA)進行分析，均數(shù)間的多重比較采用SNK-q檢驗;腫瘤

12、組織VEGF陽性率的比較采用X2檢驗方法，均以α=0.05作為差異有顯著意義的檢驗水準。
　　 結果：
　　 1、與A組（對照組）相比，燒傷組腫瘤質量增大（A組2.81±0.48g，B組3.28±0.61g，C組3.40±0.47g，P=0.022＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義）。B、C兩組間無顯著性差異(P=0.589)。
　　 2、燒傷組大鼠血清TNF-α較對照組升高（A組31.59±4.73pg/ml，B組

13、41.72±4.80pg/ml，C組42.47±5.32pg/ml，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義）。燒傷組血清VEGF值升高（A組189.04±27.43pg/ml，B組221.53±26.55pg/ml，C組214.73±37.98pg/ml，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義）。兩項指標在B、C兩組間均無顯著性差異（分別為P=0.713和P=0.388）。
　　 3、大鼠腫瘤組織免疫組化PCNA表達結果:燒傷組大鼠腫瘤組織

14、中PCNA的表達要高于對照組（A組58.30±6.61％，B組77.08±4.53％，C組81.58±4.56％，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義），C組PCNA表達要高于B組（P=0.024＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義）。
　　 4、大鼠腫瘤組織免疫組化VEGF表達結果:與對照組相比，燒傷組VEGF陽性例數(shù)增多（分別為A組4例，B組9例，C組10例，X2=7.465，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義）。
　　 討論：

15、
　　 目前越來越多的人認為腫瘤所處的局部微環(huán)境對腫瘤的生長起著不可忽視的作用，當腫瘤微環(huán)境被改變時，腫瘤生長也會受到影響。創(chuàng)傷后機體將作出應激反應，激活下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)，血液中的去甲腎上腺素、皮質醇等應激激素大量釋放，導致血管痙攣，加重組織缺血、缺氧。此外，激素對機體的免疫系統(tǒng)有抑制作用，在腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細胞，其抗腫瘤效應的下調有利于惡性腫瘤的進展、新生血管的形成及向特定部位的轉移。燒傷后

16、炎癥應答反應還會釋放大量的促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6等，可使機體免疫功能紊亂，且這些細胞因子本身就可能會對腫瘤細胞生長產(chǎn)生影響。創(chuàng)傷后機體基礎免疫能力減弱，血液中的淋巴細胞減少。VEGF是參與腫瘤新血管形成的重要生長因子，而創(chuàng)傷后可以造成血清VEGF水平升高。因此，創(chuàng)傷后在多種因素共同作用下為腫瘤的生長提供了一個有利環(huán)境。本實驗研究結果顯示，創(chuàng)傷應激使腫瘤生長速度加快，大鼠血清TNF-α、VEGF水平升高，腫瘤組織PCNA、V