新城疫病毒誘導人耐順鉑A549肺癌細胞凋亡的研究.pdf

1、順鉑(Cisplatin，DDP)是一種療效顯著的抗腫瘤藥物，對多種實體瘤均具有較好的臨床療效，因此被廣泛應用于癌癥的化療。然而，腫瘤細胞極易對順鉑產(chǎn)生耐藥，常導致化療失敗，限制了順鉑的應用。本實驗旨在研究新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)對人耐順鉑肺癌細胞(A549/DDP)的體內(nèi)外溶瘤作用及其信號轉(zhuǎn)導機制。研究發(fā)現(xiàn)，NDV能特異而高效地在A549/DDP和A549細胞中增殖，且在A549/DDP細胞中的

2、增殖能力更強，但不能在正常細胞中復制。NDV通過激活capase依賴的細胞凋亡通路、MAPK通路和Akt通路誘導體外培養(yǎng)的A549/DDP細胞凋亡，且對A549/DDP荷瘤裸鼠具有顯著的溶瘤效果。本實驗首次研究了NDV對耐藥肺癌細胞的溶瘤機制，結(jié)果表明溶瘤新城疫病毒在臨床治療順鉑耐藥肺癌中具有重要的應用前景。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1.采用TCID50法測定病毒滴度，結(jié)果表明NDV(FMW株)能特異而高效地在人耐順鉑肺癌細胞

3、(A549/DDP)中增殖，且較在其親本肺癌細胞(A549)中的增殖能力更強，但不能在MRC-5人胚肺成纖維細胞中增殖。
　　 2.FACS(AnnexinV/PI雙染法)檢測細胞凋亡，結(jié)果表明FMW感染能夠誘導A549/DDP細胞凋亡，該凋亡過程對于FMW感染具有時間依賴性。
　　 3.Hoechst33258染色觀察細胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組細胞核均呈彌散均勻的橢圓狀。FMW感染組部分細胞核切割成大小不等的致密濃染碎塊，

4、呈現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)學特征，進一步顯示FMW感染引起A549/DDP細胞凋亡。
　　 4.WesternBlot檢測凋亡相關(guān)通路的活化，結(jié)果表明FMW感染激活caspase通路，其中caspase-8介導的外源性凋亡通路起主要作用，此外，MAPK通路和Akt通路也被激活。
　　 5.采用pan-caspase抑制劑Z-VAD-FMK(50μM)預處理A549/DDP細胞后再感染FMW，F(xiàn)ACS(AnnexinV/PI雙

5、染法)檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡被明顯抑制，表明FMW誘導的A549/DDP細胞凋亡依賴于caspase的激活。
　　 6.分別用Erk1/2、Jnk、p38和Akt通路特異性抑制劑PD98059(20μM)、SP600125(10μM)、SB203580(10μM)或LY294002(10μM)預處理細胞后再感染FMW，MTT法分析細胞殺傷率。結(jié)果顯示，抑制MAPK和Akt通路均能抑制FMW誘導的A549/DDP細胞凋亡，表明

6、MAPK和Akt通路參與該凋亡過程。
　　 7.H&E染色、TUNEL法分析荷瘤裸鼠腫瘤石蠟切片，發(fā)現(xiàn)未感染組細胞基本未見凋亡，而FMW感染組細胞呈現(xiàn)典型的凋亡特征，表明FMW能誘導A549/DDP或A549荷瘤裸鼠腫瘤細胞凋亡。
　　 8.采用QRT-PCR分析FMWM基因表達并以TCID50法測定病毒滴度，研究FMW在荷瘤裸鼠瘤內(nèi)復制能力。結(jié)果表明FMW能在A549/DDP或A549荷瘤裸鼠瘤內(nèi)特異地高效復制，且在A

7、549/DDP移植瘤中復制能力更強。
　　 9.測量并計算荷瘤裸鼠腫瘤體積，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)MW顯著抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長，對A549/DDP及A549移植瘤的抑瘤效果相近，且能夠延長荷瘤裸鼠生存期。
　　 本實驗首次研究了NDV對耐藥肺癌細胞的溶瘤作用，證明NDV通過激活caspase通路、MAPK通路和Akt通路而有效誘導耐順鉑肺癌細胞凋亡，較好地克服了順鉑耐藥導致的凋亡下調(diào)，對體外培養(yǎng)的A5