小鼠大腸癌模型的構(gòu)建以及Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵因子的檢測.pdf

1、研究背景：
　　 大腸癌是一種在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率非常高的惡性腫瘤。隨著生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)變化，我國大腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國已進(jìn)入大腸癌的高發(fā)地區(qū)行列，每年新發(fā)病例約400，000，其中30-40歲的中青年患者占多數(shù)。大腸癌的防治形勢嚴(yán)峻。因此，探討大腸癌的發(fā)病機(jī)制、尋找大腸癌診斷與治療相關(guān)的靶點(diǎn)，具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路參與胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞

2、增殖與凋亡的平衡，在機(jī)體發(fā)育過程中扮演重要角色。此外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路在人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也起重要作用。有研究顯示在大腸癌組織中存在Hh信號(hào)通路的異常激活。但Hh信號(hào)通路如何影響大腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明確。氧化偶氮甲烷(AOM)是一種能特異性誘導(dǎo)大腸癌發(fā)生的化學(xué)物質(zhì)，我們采用AOM聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉(DSS)構(gòu)建小鼠大腸癌模型。并利用該動(dòng)物模型研究Hh信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的改變，為研發(fā)治療大腸癌的靶向藥物提

3、供新方向。
　　 研究目的：
　　 1、研究Hh信號(hào)通路中SuFu、Gli1及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1在AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠大腸癌中的表達(dá)變化，探討該模型在研究Hh信號(hào)通路對(duì)大腸癌發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制的價(jià)值。
　　 2、通過構(gòu)建過表達(dá)SuFu的小鼠大腸癌穩(wěn)定細(xì)胞系，研究Hh信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控因子SuFu對(duì)Gli1、CyclinD1蛋白表達(dá)的影響，探討SuFu在大腸癌形成過程中的作用機(jī)制。
　　 研

4、究方法：
　　 1、AOM/DSS聯(lián)合誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠大腸癌模型：
　　 選用體重20-24g的雌性BALB/c小鼠用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為A/D組、AOM組、DSS組及空白對(duì)照組，每組28只。實(shí)驗(yàn)第1天，按12mg/kg的劑量向A/D組、AOM小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)，向DSS組、對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積無菌生理鹽水。自第2周開始A/D組、DSS組小鼠每3周飲用3％葡聚糖硫酸鈉(Dextran

5、SulfateSodium，DSS，分子量：5000)溶液1次，每次1周，連續(xù)9周。實(shí)驗(yàn)第24周處死小鼠。以肉眼見大腸新生物形成、蘇木素/伊紅(HematoxylinFeosin，HE)染色驗(yàn)證腫瘤形成為模型構(gòu)建成功標(biāo)志。
　　 2、小鼠一般狀態(tài)的觀察和檢測
　　 (1)實(shí)驗(yàn)前9周每周稱量各組小鼠體重，觀察小鼠飲用3％DSS期間各組小鼠是否出現(xiàn)便血、腹瀉等；
　　 (2)實(shí)驗(yàn)第24周處死小鼠，肉眼觀察小鼠大腸大體

6、形態(tài)改變，測量大腸長度，HE染色觀察病理組織學(xué)改變；
　　 3、免疫組化檢測各組小鼠大腸組織、大腸癌組織中SuFu、Gli1及CyclinD1蛋白的表達(dá)水平。
　　 4、SuFu過表達(dá)小鼠大腸癌穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建：
　　 (1)構(gòu)建表達(dá)小鼠SuFu真核表達(dá)質(zhì)粒；
　　 (2)PEI法將重組質(zhì)粒pUB6/V5-His-SuFu轉(zhuǎn)染至小鼠大腸癌細(xì)胞C26，用Blasticidin篩選穩(wěn)定表達(dá)pUB6/V5-Hi

7、s-SuFu的C26細(xì)胞(C26-SuFu)，WesternBlot檢測外源性SuFu表達(dá)；
　　 5、WesternBlot檢測C26-SuFu細(xì)胞中Gli1、CyclinD1的表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 1、首次飲用3％DSS溶液后，MD組、DSS組小鼠分別有23/27、24/28只小鼠出現(xiàn)腹瀉或便血。第二次飲用3％DSS溶液后，分別有22/27，21/26只小鼠出現(xiàn)腹瀉或

8、便血。第三次飲用3％DSS溶液后，分別有17/20、18/23只小鼠出現(xiàn)腹瀉或便血。出現(xiàn)腹瀉或便血小鼠在恢復(fù)自然飲水1周后大便恢復(fù)正常。AOM組及對(duì)照組始終未出現(xiàn)腹瀉、便血。
　　 2、首次飲用3％DSS溶液1周后，各組小鼠體重變化的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.523，p<0.01)。各組小鼠增重如下：A/D組-1.33±1.52g、AOM組0.03±1.03g、DSS組-1.8±1.25g、對(duì)照組0.95±0.92g。第二

9、次、第三次飲用3％DSS溶液后，各組小鼠體重變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.968，p>0.05；F=2.557，p>0.05)。
　　 3、在實(shí)驗(yàn)第7周末，每組小鼠各處死12只，各組小鼠大腸均未見新生物。實(shí)驗(yàn)第24周處死小鼠，A/D組小鼠、DSS組小鼠大腸較對(duì)照組明顯短縮(p<0.05)。A/D組中3只(3/3)小鼠大腸可見新生物，均位于大腸遠(yuǎn)端；AOM組、DSS組及空白對(duì)照組小鼠大腸未見新生物。HE染色顯示A/D組小鼠大腸新生

10、物為癌組織；其他各對(duì)照組大腸組織腺體結(jié)構(gòu)排列整齊，無異型細(xì)胞，部分見少量炎癥細(xì)胞浸潤。
　　 4、各組小鼠大腸組織與大腸癌組織中SuFu蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.698，p<0.05)。A/D組小鼠大腸癌組織、AOM組小鼠大腸組織中SuFu蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組高(p<0.05)。A/D組大腸癌組織與AOM組、DSS組之間SuFu蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AOM組與DSS組、DSS組與對(duì)照組之間SuFu蛋白表達(dá)水

11、平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 5、各組小鼠Gli1蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.663，p<0.05)。A/D組小鼠大腸癌組織中Gli1蛋白表達(dá)水平較DSS組、對(duì)照組大腸組織高(p<0.05)。A/D組與AOM組、DSS組與對(duì)照組之間Gli1蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，AOM組與DSS組、對(duì)照組Gli1蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 6、各組小鼠Cycli

12、nD1蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=10.039，p<0.05)。A/D組小鼠大腸癌組織中CyclinD1蛋白表達(dá)水平較DSS組、對(duì)照組大腸組織高(p<0.05)。A/D組與AOM組、DSS組與對(duì)照組之間CyclinD1蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，AOM組與DSS組、對(duì)照組CyclinD1蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 1、經(jīng)PCR鑒定及DNA測序，結(jié)果顯

13、示pUB6/V5-His-SuFu真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2、WesternBlot檢測外源性SuFu，驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)SuFu小鼠大腸癌細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　 3、過表達(dá)SuFu的小鼠大腸癌穩(wěn)定細(xì)胞系中Gli1、CyclinD1的表達(dá)水平較對(duì)照組低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠大腸癌模型可用于研究Hh信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機(jī)制