采用轉(zhuǎn)基因小鼠初步探討核仁素的心肌保護作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構(gòu)建在心肌中特異性表達外源性核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠，研究核仁素在整體動物水平能否發(fā)揮心肌保護作用。
　　 方法：①利用基因重組技術構(gòu)建小鼠核仁素基因表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-Ncl)，轉(zhuǎn)染至H9C2細胞后，采用RT-PCR和Western-blot方法檢測小鼠核仁素基因在真核細胞中的表達能力；②將具有表達能力的小鼠核仁素基因序列通過基因重組方法構(gòu)建心肌特異表達外源性核仁素蛋白的表達質(zhì)粒(Alpha-MyHc clone26-

2、Ncl)，經(jīng)酶切、測序驗證其準確性；③制備心肌細胞內(nèi)特異性表達外源性核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠，采用PCR技術鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型。采用real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中核仁素基因的相對含量；采用Western-blot方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織及其他組織中核仁素蛋白的表達。④采用組織切片及髓染色法觀察轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織形態(tài)；測量心臟重量、體重、心臟重量指數(shù)；測量左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)，觀察核仁素在心肌

3、組織高表達后對小鼠心臟形態(tài)功能是否有影響。⑤應用轉(zhuǎn)基因小鼠制備心肌缺血-再灌注損傷模型，檢測心肌caspase-3活性、血清肌酸激酶活性和左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)變化，研究核仁素對心肌缺血.再灌注損傷的影響。
　　 結(jié)果：①成功構(gòu)建核仁素真核表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-Ncl)和小鼠核仁素基因的心肌特異性表達載體(Alpha-MyHc clone26-Ncl)，制備了核仁素在心肌組織內(nèi)特異性高表達的轉(zhuǎn)基因

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