TLR3在HBsAg陽(yáng)性母親新生兒乙肝疫苗無(wú)-低應(yīng)答中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 ①了解HBsAg陽(yáng)性母親新生兒臍血單個(gè)核細(xì)胞(CBMCs)表面Toll樣受體3(TLR3)與乙肝疫苗無(wú)/低應(yīng)答的關(guān)系。
　　 ②探討HBsAg陽(yáng)性母親新生兒臍靜脈血CBMCs中相關(guān)免疫細(xì)胞與乙肝疫苗無(wú)/低應(yīng)答的關(guān)系。
　　 ③探索TLR3在HBsAg陽(yáng)性母親新生兒乙肝疫苗(HepB)無(wú)/低應(yīng)答中可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 ①收集2011年7月-2012年5月于太原市第三人民

2、醫(yī)院婦產(chǎn)科分娩的HBsAg陽(yáng)性母親及其新生兒41對(duì)。采集新生兒出生時(shí)30mL臍血及3mL股靜脈血。采用面對(duì)面問(wèn)卷調(diào)查方法收集母兒的流行病學(xué)資料。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)母親及其新生兒出生24小時(shí)內(nèi)外周血乙肝病毒標(biāo)志物及HBV DNA含量。
　　 ②新生兒按照0，1，6程序完成乙肝疫苗全程免疫后，于新生兒12±1個(gè)月齡時(shí)采集其股靜脈血5ml，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其血清中抗-HBs含量

3、，了解HBsAg陽(yáng)性母親新生兒乙肝疫苗無(wú)/低應(yīng)答率。
　　 ③采用密度梯度離心法分離新生兒臍靜脈血CBMCs，乙肝疫苗無(wú)/低應(yīng)答組和高應(yīng)答組均分為三組進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，包括HBV(-)對(duì)照組、細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h分別用PolyI∶C、HBV刺激活化CBMCs的PolyI∶C+HBV(+)刺激組、培養(yǎng)48h后僅用HBV進(jìn)行刺激的HBV(+)刺激組。且于HBV刺激72小時(shí)后收集細(xì)胞。
　　 ④采用多色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢

4、測(cè)兩組TLR3的蛋白表達(dá)水平以及DCs、T細(xì)胞、CD4+CD25+Treg和B細(xì)胞的百分比。
　　 結(jié)果:
　　 ①HepB高應(yīng)答組CBMCs細(xì)胞經(jīng)HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后TLR3蛋白水平均低于HBV(-)組;HepB無(wú)/低應(yīng)答HBV感染組與HBV(-)組相比，TLR3蛋白水平較低，經(jīng)PolyI∶C刺激后，無(wú)/低應(yīng)答組CBMCs細(xì)胞表面TLR3蛋白含量高于HBV(+)組。CBMCs經(jīng)HBV和PolyI∶C+

5、HBV刺激后，細(xì)胞表面TLR3蛋白含量在HepB高應(yīng)答組與無(wú)/低應(yīng)答組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.94，P=0.35; t=0.23, P=0.81)。
　　 ②HepB高應(yīng)答組經(jīng)HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后mDC與pDC的比值均高于HBV(-)組;HepB無(wú)/低應(yīng)答HBV(+)組mDC與pDC比值低于HBV(-)，但高于PolyI∶C+HBV(+)組。CBMCs經(jīng)HBV和PolyI∶C+HBV刺激后，mDC與pDC

6、的比值在HepB高應(yīng)答組與無(wú)/低應(yīng)答組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.27,P=0.78;t=0.33, P=0.78)。
　　 ③HepB高應(yīng)答組經(jīng)HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比值低于對(duì)照組;HepB無(wú)/低應(yīng)答HBV(+)組CD4+T/CD8+T比值高于HBV(-)組和PolyI∶C+HBV(+)組。乙肝疫苗高應(yīng)答組與無(wú)/低應(yīng)答組CBMCs經(jīng)HBV及PolyI∶C+HBV刺激活化后，兩組C

7、D4+T與CD8+T細(xì)胞比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.54, P=0.58; t=0.40, P=0.68)。
　　 ④HepB高應(yīng)答組經(jīng)HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后Treg細(xì)胞百分比均低于HBV(-)組;HepB無(wú)/低應(yīng)答HBV(+)組Treg細(xì)胞百分比高于HBV(-)組和PolyI∶C+HBV(+)組。乙肝疫苗高應(yīng)答組與無(wú)/低應(yīng)答組CBMCs經(jīng)HBV及PolyI∶C+HBV刺激活化后，兩組CD4+CD25+Treg

8、細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.29, P=0.77; t=0.10, P=0.92)。
　　 ⑤HepB高應(yīng)答組經(jīng)HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后B細(xì)胞百分比低于HBV(-)組;HepB無(wú)/低應(yīng)答組HBV(+)組B細(xì)胞百分比高于HBV(-)組和PolyI∶C+HBV(+)組。乙肝疫苗高應(yīng)答組與無(wú)/低應(yīng)答組CBMCs經(jīng)HBV刺激后，兩組B細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.12，P=0.87)。而經(jīng)PolyI∶C+HB

9、V刺激活化，兩組B細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.78，P=0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 ①乙肝疫苗無(wú)/低應(yīng)答對(duì)照組的TLR3蛋白略低于高應(yīng)答組，在經(jīng)PolyI∶C刺激后其表達(dá)水平略高于高應(yīng)答組，提示PolyI∶C可作為TLR3配體提高無(wú)/低應(yīng)答者CBMCs細(xì)胞表面的TLR3受體水平。
　　 ②經(jīng)PolyI∶C刺激后乙肝疫苗無(wú)/低應(yīng)答者CBMCs細(xì)胞表面TLR3蛋白表達(dá)水平略高于HBV(+)組，且mDC與