TLR3在持續(xù)低灌注小鼠肝臟熱缺血損傷中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、肝臟移植(liver transplantation，LT)經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展已經(jīng)成為挽救無數(shù)終末期良惡性肝病患者生命最有效的手段之一。然而，隨著肝移植技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越長的供體等候隊列名單使得很多終末期肝病患者在等待移植的過程中死亡。供體資源緊缺成為包括肝移植在內(nèi)的實(shí)體器官移植所面臨的嚴(yán)峻問題。為了擴(kuò)展供體來源解決供體稀缺問題，包括活體肝移植、劈離式肝移植、心死亡器官捐獻(xiàn)(donation aftercardiac death，

2、DCD)等技術(shù)手段在全世界進(jìn)行了深入的研究和廣泛的開展。其中DCD是目前擴(kuò)展供體來源最重要的手段之一。
　　從上世紀(jì)五十年代DCD供體被最早用于腎移植，到六十年代后因術(shù)后并發(fā)癥和死亡率高的問題而被DBD供體取代，再到九十年代為解決緊張的供受體供需關(guān)系而再次被使用并深入展開相關(guān)研究，DCD器官移植發(fā)展至今已經(jīng)過了半個多世紀(jì)的歷史，并取得了十分顯著的成果。盡管如此，目前DCD肝移植的預(yù)后仍不如DBD肝移植。DCD肝移植術(shù)后原發(fā)性移植肝

3、無功能（PNF）、缺血性膽道病變(ITBL)、肝動脈栓塞(HAT)等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率顯著高于DBD肝移植，移植肝早期失功能一旦發(fā)生常常需要再次移植，其治療費(fèi)用不但昂貴且手術(shù)風(fēng)險顯著提高。因此，如何降低DCD肝移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率，提高患者及移植物生存率吸引了大家的高度關(guān)注。
　　DCD供肝在移植前所經(jīng)歷的低灌注以及熱缺血損傷是影響肝移植預(yù)后的主要因素。DCD供體的死亡診斷標(biāo)準(zhǔn)是基于患者心肺功能的不可逆喪失，在這一過程中，機(jī)會不

4、可避免的會經(jīng)歷一段缺氧和低血壓的時期導(dǎo)致肝臟灌注減低，而肝臟作為機(jī)體最大的代謝器官，本身對缺氧和低血壓十分敏感，極容易受到缺氧損傷。盡管血管活性藥物以及呼吸機(jī)的使用能在一定程度上改善DCD供體的缺氧和低血壓情況，然而肝臟內(nèi)微循環(huán)障礙甚至衰竭并無法得到有效的逆轉(zhuǎn)，而肝竇作為半開放的管腔極易受到缺血性損傷。在撤除血管活性藥和呼吸機(jī)等維持DCD供體生命體征的治療后，供肝從身體取出前還會經(jīng)歷一段完全的熱缺血時間，其長短會對供肝的組織活力和功能產(chǎn)

5、生極大影響。因此研究DCD供肝低灌注后熱缺血損傷機(jī)制是改善DCD肝移植預(yù)后的關(guān)鍵。然而，目前對熱缺血損傷機(jī)制的研究并不明確。
　　DCD肝移植預(yù)后差于DBD肝移植的現(xiàn)象并未發(fā)生在DCD腎移植中，這提示我們肝臟因缺氧和低血壓引起的熱缺血損傷機(jī)制不同于其他器官。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，肝臟是機(jī)體最重要的代謝器官，而現(xiàn)在越來越多的研究表明，肝臟除了是一個重要的代謝器官外，還是一個以固有免疫為主體的免疫器官。NK、NKT細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞占肝內(nèi)總淋

6、巴細(xì)胞的一半以上。因此，固有免疫對DCD供肝低灌注和熱缺血損傷的免疫調(diào)控與應(yīng)答是區(qū)別于DCD腎移植的重要因素。
　　Toll樣受體(toll-like receptor，TLRs)做為固有免疫最重要PRRs之一，不僅可以識別細(xì)菌、病毒等外源性配體，還能識別體內(nèi)的各種危險信號，十分廣泛的參與了肝臟的局部免疫應(yīng)答與調(diào)控，并且在肝臟缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)中發(fā)揮著重要的作用。TLR1-9廣泛表達(dá)于肝內(nèi)

7、各類細(xì)胞表面以及細(xì)胞內(nèi)，其中，TLR3表達(dá)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、DC細(xì)胞以及肝內(nèi)淋巴細(xì)胞中。研究結(jié)果表明，TLR4-/-、TLR9-/-可以顯著減輕肝臟缺血再灌注損傷。而最新的研究顯示，TLR3在介導(dǎo)腎臟IR損傷中也發(fā)揮了重要的作用。這進(jìn)一步提示我們TLRs在肝臟局部固有免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，我們由此猜測以TLRs為主要受體的固有免疫很可能介導(dǎo)了DCD供肝熱缺血損傷的發(fā)生。
　　目前尚無模擬D

8、CD供肝狀態(tài)的穩(wěn)定動物模型，我們通過門靜脈結(jié)扎的方法建立小鼠肝臟持續(xù)低灌注模型，這在一定程度上能夠模擬DCD供肝的低灌注狀況，尤其是對馬氏Ⅲ類供體而言。我們采用TLRs基因敲除小鼠建立低灌注模型后，通過肝功能和病理評估肝損傷情況，探究以TLRs為主要受體的固有免疫反應(yīng)對小鼠低灌注后熱缺血損傷的潛在作用，通過安捷倫小鼠表達(dá)譜芯片分析以及流式細(xì)胞術(shù)等方法研究固有免疫介導(dǎo)和調(diào)控?zé)崛毖獡p傷的潛在機(jī)制。通過對小鼠熱缺血損傷機(jī)制的研究也能在一定程度

9、上為明確臨床DCD供肝熱缺血損傷機(jī)制提供有意義的指導(dǎo)和借鑒。
　　一、模擬心死亡器官捐獻(xiàn)供肝狀態(tài)的小鼠肝臟持續(xù)低灌注模型
　　目的:建立穩(wěn)定的小鼠肝臟持續(xù)低灌注模型，并在此基礎(chǔ)上研究肝臟持續(xù)低灌注對小鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響。
　　方法:建模選用6-8周齡C57BL/6小鼠，將門靜脈縮窄至1ml注射器針頭直徑，門靜脈縮窄后3d、7d、14d和21d行肝功能及肝臟組織病理學(xué)檢測，選用穩(wěn)定的模型小鼠行70％缺血再灌注手

10、術(shù)，再灌注3h、24h、48h后行肝功能及肝臟組織病理學(xué)檢測，對照組采用正常C57BL/6小鼠行缺血再灌注手術(shù)。
　　結(jié)果:小鼠門靜脈縮窄術(shù)后，術(shù)后ALT和AST均顯著升高(F=68.9，p＜0.001)，并在7d時達(dá)到高峰(ALT:60.8±6.2U/L vs25.5±2.8U/L，p＜0.001;AST:74.9±6.1U/Lvs39.1±3.2U/L，p＜0.001)，同時HE染色顯示7d時肝細(xì)胞損傷最重，并且有較多炎細(xì)胞浸

11、潤，在21d時，ALT基本恢復(fù)正常(p=0.12)，而AST仍高于正常水平(p=0.03);低灌注處理7d的小鼠進(jìn)行缺血再灌注手術(shù)后，肝酶和組織病理學(xué)檢查顯示肝細(xì)胞損傷較對照組顯著加重，肝酶在再灌注3h達(dá)到高峰(ALT:8217.0±1111.8U/L vs5597.4±1015.3U/L,p=0.004; AST:8548.2±1155.4U/L vs5765.4±956.9U/L, p=0.003)，再灌注48h時，對照組小鼠ALT

12、和AST均恢復(fù)正常，而經(jīng)過低灌注處理的小鼠肝酶仍顯著高于對照組(ALT:608.8±442.9U/L vs47.4±20.1U/L，p=0.008;AST:861.8±442.8U/L vs70.8±68.3U/L,p=0.008)。
　　結(jié)論:我們成功建立了穩(wěn)定的小鼠肝臟持續(xù)低灌注模型，經(jīng)持續(xù)低灌注處理后的肝臟對熱缺血再灌注損傷的耐受能力顯著降低，這在一定程度上能夠模擬臨床上DCD供肝的狀況。
　　二、小鼠TLR3-/-對

13、DCD供肝熱缺血損傷的影響及潛在機(jī)制研究
　　目的:在小鼠肝臟持續(xù)低灌注模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究小鼠TLR3對肝臟持續(xù)低灌注后熱缺血損傷的作用和機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)組采用相同體重、周齡的TLR3-/-、TLR4-/-、TLR9-/-、MyD88-/-小鼠建立小鼠肝臟持續(xù)低灌注模型，對照組采用WT小鼠建立模型，通過肝功能及肝臟組織病理學(xué)檢測比較各組小鼠肝臟低灌注后熱缺血損傷程度;另選TLR-3-/-（實(shí)驗(yàn)組）和WT（對照組）小

14、鼠建立穩(wěn)定的肝臟持續(xù)低灌注模型后，對小鼠行70％缺血再灌注手術(shù)，再灌注3h、24h、48h后行肝功能及肝臟組織病理學(xué)檢測，比較兩組小鼠經(jīng)持續(xù)低灌注處理后的肝臟對熱缺血再灌注損傷的耐受能力;分離、提取經(jīng)低灌注處理的WT小鼠肝臟淋巴細(xì)胞和低灌注處理后行缺血再灌注手術(shù)WT小鼠的外周血單核細(xì)胞，進(jìn)行安捷倫小鼠表達(dá)譜分析;分離提取經(jīng)低灌注處理的WT、TLR3-/-小鼠肝臟淋巴細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測低灌注肝臟T、B淋巴細(xì)胞的變化情況;
　　

15、結(jié)果:在肝臟持續(xù)低灌注模型中，TLR4、TLR9、MyD88缺陷小鼠ALT和AST水平與WT小鼠相比無明顯差異，而TLR3-/-小鼠ALT、AST水平顯著低于WT小鼠(ALT:35.0±10.7vs.68.0±8.8, p＜0.001;AST:39.9±9.4vs.75.1±63, p＜0.001),HE染色顯示TLR3-/-小鼠肝細(xì)胞損傷輕于WT小鼠，同時炎細(xì)胞浸潤明顯減少;經(jīng)過低灌注處理的TLR3-/-小鼠肝臟同WT小鼠相比，肝缺血

16、再灌注損傷明顯減輕，TLR3-/-和WT小鼠肝酶在再灌注3h達(dá)到高峰(ALT:4519.6±1025.7U/L vs.7634.4±742.U/L，p＜0.001; AST:4009.2±1201.3U/L vs.7961.4±977.2U/L，p＜0.001)，再灌注48小時TLR3-/-小鼠ALT和AST雖未恢復(fù)正常，但顯著低于WT小鼠(ALT:129.4±114.3U/L vs.669.4±201.8U/L,p=0.001;AST

17、:175.4±156.8U/L vs.653.8±251.6U/L，p=0.007)。HE染色顯示，同WT小鼠相比，TLR3-/-小鼠肝細(xì)胞損傷明顯減輕，特別是幾乎無淋巴細(xì)胞浸潤;表達(dá)譜芯片分析結(jié)果顯示，低灌注肝臟中出現(xiàn)了B細(xì)胞特有表面分子CD19、CD20的表達(dá)以及B細(xì)胞活化因子Baff的升高，同時趨化因子CCL7、CCL2、CXCL4表達(dá)升高，作為危險內(nèi)源性信號的HSPA4也出現(xiàn)表達(dá)，對經(jīng)過低灌注處理WT小鼠行缺血再灌注手術(shù)后檢測外

18、周血單核細(xì)胞表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在固有免疫通路下游信號（包括干擾素誘導(dǎo)基因、細(xì)胞因子）出現(xiàn)異?；罨憩F(xiàn)，特別是IP-10等趨化因子以及趨化因子受體出現(xiàn)爆發(fā)式升高;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)持續(xù)肝臟低灌注7d的WT小鼠肝臟中出現(xiàn)了大量B細(xì)胞侵潤;而與之相反的，TLR3缺陷小鼠肝臟的B淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論:TLR3-/-能顯著減輕小鼠持續(xù)低灌注后熱缺血損傷，增加低灌注肝臟對缺血再灌注損傷的耐受性。其機(jī)制可能在于，TLR3的缺陷阻斷