與Coronin3相互作用的F-actin核化相關(guān)分子Arp2調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、【背景】:
　　胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在所有腫瘤中居第四位,死亡率居第二位,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。胃癌患者的預(yù)后較差,5年生存率較低。由于早期胃癌的癥狀不明顯,患者就診時(shí)胃癌常進(jìn)入中晚期,且伴隨著淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。這是胃癌患者治療失敗和死亡的重要原因之一。因此,尋找與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子對(duì)提高胃癌的治療效果尤為重要。
　　本研究所前期利用雜交瘤技術(shù)篩選出一系列特異性較高的胃癌相關(guān)單克隆抗體,其中MGb2-

2、Ag與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜分析我們發(fā)現(xiàn)Coronin家族成員Coronin3是與MGb2-Ag相互作用的分子。Coronin家族成員參與了細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞偽足的形成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng);肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架存在兩種形式,即球肌動(dòng)蛋白(G-actin)和絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)。其中F-actin核化又是細(xì)胞骨架重組的重要步驟,核化即幾個(gè)蛋白單體先組裝成多聚體,然后其他單體繼續(xù)添加形成長(zhǎng)纖維分子。由此我們推測(cè),Coroni

3、n3可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞F-actin核化進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足形成,從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　本研究通過(guò)免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)F-actin核化相關(guān)蛋白Arp2是與Coronin3發(fā)生相互作用的分子。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Arp2在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)明顯高于原發(fā)灶,其在高轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細(xì)胞亞系MKN28-M中的表達(dá)水平亦顯著高于低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞亞系MKN28-NM及其親本細(xì)胞MKN28。通過(guò)功能獲得性和缺失性研究,我們

4、證實(shí)了Arp2能夠在體外顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究有助于深入闡明細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制,為有效干預(yù)胃癌轉(zhuǎn)移提供新的治療策略。
　　【目的】:
　　1、研究Coronin3在胃癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系;
　　2、篩選可與Coronin3相互作用的F-actin核化相關(guān)分子;
　　3、研究目標(biāo)分子在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系;
　　4、研究目標(biāo)分子對(duì)胃癌侵襲

5、轉(zhuǎn)移能力的調(diào)節(jié)作用;
　　【方法】:
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)Coronin3在胃癌和匹配癌旁組織中的表達(dá)情況并分析其表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;利用Kaplan-Meier方法繪制出生存曲線(xiàn)并分析Coronin3與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系;
　　2.采用免疫沉淀技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)分析篩選與Coronin3相互作用的F-actin核化分子,并通過(guò)免疫沉淀驗(yàn)證;
　　3.采用免疫

6、組織化學(xué)檢測(cè)其在胃癌中的表達(dá)情況;分析目標(biāo)分子的表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系;利用Kaplan-Meier方法繪制出生存曲線(xiàn)并分析其與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系;
　　4.采用westernblot和qPCR檢測(cè)目標(biāo)分子在各胃癌細(xì)胞系中的表達(dá);構(gòu)建目標(biāo)分子的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及siRNA,對(duì)低表達(dá)和高表達(dá)目標(biāo)分子的胃癌細(xì)胞系分別進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,通過(guò)細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等研究其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　【結(jié)果】:

7、>　　1.Coronin3在癌旁組織中的陽(yáng)性率為50.7％(38/75),在胃癌中的陽(yáng)性率為68%(51/75);Coronin3與胃癌患者的性別和年齡無(wú)關(guān),但與胃癌的分化程度及TNM分期存在密切的相關(guān)性,且分化程度越低,TNM分期越高,其在胃癌中的表達(dá)越強(qiáng);Coronin3的表達(dá)還與患者的生存時(shí)間具有相關(guān)性,Coronin3高表達(dá)的胃癌患者生存時(shí)間相對(duì)較短。
　　2.選擇胃癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MKN28-M進(jìn)行免疫沉淀,再經(jīng)質(zhì)譜及生物

8、信息學(xué)分析獲得了與Coronin3相互作用的分子——肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2(Actin-relatedprotein2,Arp2),匹配序列為GYAFNHSADFETVR。免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)提示這兩個(gè)分子間存在相互作用關(guān)系。
　　3.Arp2在胃癌中的陽(yáng)性率為62.7%(47/75),在癌旁組織中的陽(yáng)性率為21.3%(16/75);其在原發(fā)灶的陽(yáng)性率為52.5%(21/40),在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的陽(yáng)性率為82.5%(33/40);Arp2的

9、表達(dá)與性別和年齡無(wú)關(guān),但與胃癌的分化程度及TNM分期存在密切的關(guān)系,并且分化程度越低,TNM分期越高,其在胃癌中的表達(dá)越強(qiáng);隨著Arp2表達(dá)的增強(qiáng),胃癌患者的生存時(shí)間逐漸縮短。
　　4.Westernblot及qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示Arp2在胃癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MKN28-M中的表達(dá)高于親本細(xì)胞MKN28及低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MKN28-NM,而在人永生化胃粘膜上皮細(xì)胞GES中呈低表達(dá)。下調(diào)MKN28-M中Arp2的表達(dá)可抑制細(xì)胞的體外遷移和

10、侵襲能力;上調(diào)MKN28-NM中的Arp2則促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲。
　　【結(jié)論】:
　　本研究發(fā)現(xiàn)Coronin3與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了Arp2是與Coronin3相互作用的F-actin核化分子,其表達(dá)與胃癌的分化和TNM分期相關(guān),在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性率高于原發(fā)灶。此外,Arp2還與胃癌患者的生存期相關(guān),表達(dá)越高,生存期越短。Arp2在胃癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MKN28-M中表達(dá)高于親本細(xì)