自噬參與低氧后處理對成年大鼠短暫全腦缺血的保護作用.pdf

1、背景與目的：大鼠短暫全腦缺血可引起特定區(qū)域如海馬的神經(jīng)元發(fā)生延遲死亡。機體在短時間內(nèi)暴露于非致死性的損傷因素，如非損傷性的缺血、皮層擴布性抑制、短暫性癲癇發(fā)作、麻醉劑吸入、低劑量的脂多糖內(nèi)毒素等，可減輕后續(xù)的嚴(yán)重性、致死性的缺血或缺氧損傷，此為缺血耐受。在致死性的缺血再灌注之后的一定時間內(nèi)，給予一次或者多次短暫缺血再灌注，使腦組織對致死性的缺血產(chǎn)生耐受，此為腦缺血后處理。作為一種腦缺血后處理的方式，低氧后處理發(fā)揮神經(jīng)元保護作用的機制尚不

2、清楚。我們先前應(yīng)用TUNEL法研究結(jié)果顯示，成年大鼠tGCI再灌注24小時開始出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，再灌注48小時凋亡細(xì)胞增多，再灌注7天凋亡細(xì)胞數(shù)下降。自噬是否參與短暫全腦缺血所致的神經(jīng)元損傷，低氧后處理是否通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮神經(jīng)保護作用，尚不清楚。本研究檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、LAMP2、Cathepsin D在短暫全腦缺血和短暫全腦缺血-低氧后處理后海馬CA1區(qū)的表達(dá)變化，以及觀察電鏡下自噬體的形成，闡明自噬是否參與低氧后處理對短暫全腦

3、缺血的保護作用。
　　材料與方法：選取體重為250-300 g的成年雄性Wistar大鼠。低氧后處理采用在密閉防潮箱內(nèi)持續(xù)通入8％ O2+92% N2混合氣體。全腦缺血模型采用Pulsinelli經(jīng)典的四血管阻塞模型。采用電鏡觀察神經(jīng)元內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化及自噬體的形成，采用免疫組化、Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、LAMP2、Cathepsin D在短暫全腦缺血和低氧后處理后海馬CA1區(qū)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：

4、（1）電鏡下 Sham組神經(jīng)元核膜完整，核內(nèi)染色體淡染，胞漿可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和形態(tài)正常的線粒體。tGCI組再灌注26小時，胞漿內(nèi)線粒體腫脹，并出現(xiàn)少量自噬體，可見部分自噬體內(nèi)的胞漿成分已降解，呈高電子密度。在再灌注50小時，胞漿內(nèi)自噬體明顯增多。再灌注7天，細(xì)胞器崩解，組織壞死，未見正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。HPC組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，可見胞核、線粒體、溶酶體等細(xì)胞器，并見少量的雙層膜自噬體。
　　（2）LC3免疫陽性成分在短暫全腦缺血后

5、，局部聚集，給予低氧后處理，LC3均勻分布至胞漿。Western blot結(jié)果顯示，tGCI組LC3-Ⅱ/Ⅰ逐漸升高,在再灌注50小時，達(dá)到高峰（p<0.05）。
　　（3）Sham組LAMP2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞在錐體細(xì)胞層呈圓形、卵圓形（神經(jīng)元樣），多形層、分子層的免疫陽性細(xì)胞呈梭形、星形（膠質(zhì)細(xì)胞樣）。單純低氧后24小時，神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，缺血后4小時，神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)一過性增多，至缺血后168小時，低于S

6、ham組水平（p<0.05）。給予tGCI鼠低氧后處理后，神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)在低氧后24小時、6天與對應(yīng)時間點的tGCI組比較，變化不明顯（p>0.05），低氧后0小時低于對應(yīng)時間點的tGCI組（p<0.05）。單純低氧后0小時、24小時，膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)無明顯變化（p>0.05）。在再灌注0小時，即開始增多，在再灌注50小時達(dá)高峰，并維持至再灌注7天，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。tGCI后給予低氧后處理，低氧后6天膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)

7、較對應(yīng)時間點的tGCI組增多（p<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，單純低氧后24小時，LAMP2表達(dá)增多（p<0.05）；tGCI后，在再灌注0小時升高。在4小時、26小時、50小時均無明顯變化，在低氧后0小時、24小時，與對應(yīng)時間點的tGCI組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　（4） Sham組海馬CA1區(qū)Cathepsin D免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞胞體大而圓，分子層突起長而明顯。與 Sham組比較，單純低氧0小時、24小時

8、變化不明顯。在tGCI組，陽性細(xì)胞的光密度值在再灌注0小時、50小時、168小時降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；在再灌注4小時至26小時，維持在Sham水平；tGCI后，給予低氧后處理后24小時、6天，Cathepsin D表達(dá)量升高，均恢復(fù)至Sham水平，與相應(yīng)時間點的tGCI組比較，p<0.05。Western blot結(jié)果顯示與Sham組比較，單純低氧0小時、24小時略升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；tGCI后，在再灌注0小時達(dá)到高峰，并維持

9、至26小時，在再灌注50小時降低至Sham水平；tGCI后給予低氧后處理，在低氧后0小時，與對應(yīng)時間點的tGCI組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在低氧后24小時，與對應(yīng)時間點的tGCI組比較，略升高，但差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）LAMP2免疫熒光雙標(biāo)顯示，Sham組 LAMP2主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，在CA1腹內(nèi)側(cè)主要在神經(jīng)元胞漿表達(dá)。tGCI組再灌注7天，LAMP2主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。
　　結(jié)論：（1）自噬在短暫全腦缺血后