牛結(jié)核病DNA疫苗的研究.pdf

1、牛結(jié)核病是主要由牛分枝桿菌引起的一種慢性消耗性疾病,在許多國(guó)家尤其是發(fā)展中國(guó)家仍廣泛流行,該病不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且嚴(yán)重威脅著人類的身心健康.因此,控制牛結(jié)核病對(duì)防治人類結(jié)核病意義重大.然而,至今仍沒(méi)有一種疫苗可用于該病的預(yù)防. 本研究利用PCR技術(shù)和重疊延伸剪接技術(shù)(splice by overlapping extension,SOE),以牛分枝桿菌Vallee Ⅲ菌株的基因組為模板,擴(kuò)增ag85b、esat-

2、6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65.esat-6、mpb64-esat-6融合基因,連接到真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Ag85B(簡(jiǎn)稱pCA)、pCDNA3.1-ESAT-6(簡(jiǎn)稱pCE6)、pCDNA3.I-HSP65(簡(jiǎn)稱pcH)、pCDNA3.1-MPB64 (簡(jiǎn)稱pCM) pCDNA3.1-Ag85B.ESAT-6 (簡(jiǎn)稱pCAE)、pCDNA3.1-HS

3、P65.ESAT-6(簡(jiǎn)稱pCHE)和pCDNA3.1-MPB64.ESAT-6(簡(jiǎn)稱pCME).轉(zhuǎn)染SP2/0細(xì)胞,檢測(cè)目的基因的表達(dá).以各重組質(zhì)粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠,免疫3次,每次間隔2周,1免后每周以牛分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)為包被抗原,間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體水平;以牛分枝桿菌PPD和刀豆蛋白A(ConcanavalinA,C

4、onA)為刺激原,MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況.3免2周后以ELISA試劑盒檢測(cè)脾細(xì)胞分泌IFN-γ,的情況.結(jié)果表明,除pCH組外,其他各重組質(zhì)粒免疫后小鼠血清抗體水平持續(xù)上升,與pCDNA3.1(+)對(duì)照組和PBS對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05).3免2周后,融合DNA疫苗免疫組的刺激值(SI值)與單價(jià)DNA疫苗免疫組相比差異顯著(p<0.05).PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ高于單價(jià)DNA疫苗組

5、(p<0.05),而ConA刺激后各疫苗組分泌的IFN--γ水平均高于PPD刺激時(shí)(p<0.05),其中以pCAE和pCME組最高.以上結(jié)果表明在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答方面融合DNA疫苗要優(yōu)于單價(jià)DNA疫苗. 同樣,利用PCR和SOE技術(shù),獲得牛分枝桿菌mpb64-ag85b和mpb64-ag85b-esat-6融合基因,以pCDNA3.1(+)為載體構(gòu)建了牛分枝桿菌多價(jià)組合和多基因融合DNA疫苗:二基因融合(pCDNA3.1-MPB

6、64-Ag85B,簡(jiǎn)稱pcMA)和三基因融合(pCDNA3.1-MPB64-Ag85B-ESAT-6,簡(jiǎn)稱pCMAE)DNA疫苗;二價(jià)組合(pCA+pCM)和三價(jià)組合(pCA+pCM+pCE6)DNA疫苗,免疫BALB/c小鼠,以牛分枝桿菌BCG免疫組為陽(yáng)性對(duì)照,以pCDNA3.1(+)及PBS免疫組為陰性對(duì)照,共免疫3次,每次間隔2周,BCG組僅初免時(shí)皮下免疫1次.1免后每周,以原核表達(dá)純化的重組MPB64-Ag85B-ESAT-6蛋

7、白(rMAE)和牛分枝桿菌PPD為包被抗原,以間接ELISA方法檢測(cè)血清lgG水平及IgG亞類.每次免疫2周后以rMAE蛋白和PPD刺激,MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況,試劑盒檢測(cè)IFN-γ.,和IL.2的分泌情況.3免3周后以1×10<'6>CFU的BCG進(jìn)行攻毒.攻毒3周后,以間接免疫熒光試驗(yàn)、肺臟荷菌數(shù)和病理組織學(xué)變化評(píng)價(jià)攻毒后的免疫保護(hù)效果.試驗(yàn)結(jié)果表明,融合DNA疫苗免疫后產(chǎn)生的血清抗體水平、淋巴細(xì)胞增值(SI值)水平、IFN

8、-γ和IL-2水平明顯高_(dá)丁多價(jià)DNA疫苗(p<0.05),以rMAE蛋白為包被抗原和刺激原時(shí)BCG免疫組的抗體水平、SI值和分泌的IFN-γ,IL-2的量明顯低于融合DNA疫苗組,而與多價(jià)DNA疫苗組相當(dāng),以牛分枝桿菌PPD為包被抗原和刺激原時(shí)BCG免疫組的體液和細(xì)胞免疫指標(biāo)均明顯優(yōu)于各DNA疫苗組.從攻毒保護(hù)效果來(lái)看,融合DNA疫苗組的保護(hù)效果明顯優(yōu)于多價(jià)DNA疫苗,達(dá)到了BCG疫苗的免疫保護(hù)水平,表明本研究制備的融合DNA疫苗具有