乙型肝炎病毒多聚酶蛋白拮抗Ⅰ型干擾素通路的機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一種嚴重危害人類健康的病原體，可導致急慢性乙型肝炎、肝硬化，并與肝細胞癌的發(fā)生密切相關。目前臨床上尚無特異性根治慢性乙肝的手段，一般采用核苷類藥物及α干擾素(interferon，IFN)來抑制HBV復制以最大程度減輕和延緩HBV慢性感染所導致的肝臟免疫病理損傷。其中IFN-α作為具有直接抗病毒效應和免疫調節(jié)作用的細胞因子是宿主抗病毒天然免疫應答的重要組成部分，其在體內由宿主模

2、式識別受體(PatternRecognition Receptor，PRR)介導的通路誘生，并經由Ⅰ型干擾素效應通路發(fā)揮抗病毒和免疫調節(jié)作用。雖然大量體內外研究已證實IFN-α具有抑制HBV轉錄復制的作用，但是臨床上慢性HBV感染患者對IFN-α治療的應答率僅約30％，提示HBV可能存在拮抗Ⅰ型干擾素效應通路的策略。
　　本課題組前期工作表明HBV編碼的多聚酶蛋白(polymerase，Pol)具有抑制IFN-α誘導的MyD88轉

3、錄的功能。本研究旨在進一步明確Pol在HBV拮抗IFN-α效應過程中的角色，在此基礎上深入觀察Pol對IFN-α激活的JAK-STAT(signaltransducer and activator of transcription)通路的抑制作用，并揭示其中分子機制，以加深人們對HBV拮抗Ⅰ型干擾素通路及逃逸宿主抗病毒天然免疫應答機制的認識。
　　首先在HBV復制和Pol過表達的細胞中采用熒光報告基因檢測和實時熒光定量PCR確認了

4、HBV和Pol對于IFN-α誘導的干擾素刺激反應元件(ISRE)活化及下游抗病毒基因轉錄的抑制作用。同時在基于高壓尾靜脈質粒注射的小鼠轉染模型中也觀察到，HBV和Pol的表達抑制了mIFN-α誘導的小鼠干擾素刺激基因(ISGs)的轉錄。為從生物學意義上確認HBV和Pol的表達削弱了IFN-α介導的抗病毒天然免疫應答，將VSV用作感染指示病毒行病毒保護實驗，免疫熒光觀察及細胞培養(yǎng)上清病毒滴定的結果均顯示，HBV和Pol的存在顯著削弱了IF

5、N-α誘導的細胞抗VSV感染的能力。以siRNA干擾HBV復制細胞中Pol的表達后，HBV拮抗ISRE活化的能力明顯減弱，確認了Pol在HBV抑制IFN-α效應過程中的重要角色。
　　為進一步探尋Pol對Ⅰ型干擾素介導的信號轉導的影響，通過免疫印跡及免疫熒光觀察了Pol對信號通路相關分子表達以及IFN-α誘導的STAT分子活化的影響，發(fā)現(xiàn)Pol對IFNAR1、IFNAR2、JAK1、Tyk2、STAT1、STAT2、IRF9、Im

6、portin-α5等分子的本底表達，以及STAT1-701位酪氨酸磷酸化和STAT1-STAT2異聚體的形成無明顯影響，但Pol對與STAT1轉錄活性密切相關的STAT1-727位絲氨酸磷酸化及STAT1、STAT2的入核有顯著抑制作用。小鼠高壓尾靜脈質粒注射模型中的結果驗證了Pol對STAT1-727位磷酸化的抑制;而在IFN-α離體處理的慢性乙肝病人肝穿標本中，本研究首次證實相較未感染HBV肝細胞中STAT1和STAT2大多分布于核

7、中，HBV感染肝細胞中的STAT1和STAT2則主要滯留于胞漿，有力地支持了細胞系內觀察到的現(xiàn)象。
　　進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，Pol與負責調節(jié)STAT1-727位磷酸化的PKC(proteinkinase C)-δ激酶蛋白的催化亞基存在相互作用，且抑制了IFN-α誘導的PKC-δ磷酸化及其與STAT1的結合。另一方面，免疫共沉淀實驗結果顯示Pol以濃度依賴的方式抑制了核漿運輸?shù)鞍譏mportin-α5與STAT1和STAT2的相互作

8、用;GST-pull down實驗和截短突變分析進一步顯示，Pol與核漿運輸?shù)鞍譏mportin-α5存在相互作用，且Pol與Importin-α5相互作用的區(qū)段和Importin-α5與STAT1-STAT2異聚體結合的區(qū)段互相重疊，提示Pol可能通過與Importin-α5的競爭性結合阻礙了其介導的STAT1和STAT2的入核。
　　鑒于Pol蛋白由末端蛋白(terminal protein，TP)、連接區(qū)(spacer，SP

9、)、逆轉錄酶區(qū)(reverse transcriptase，RT)和RNaseH(RH)區(qū)等構成，通過構建并轉染編碼Pol各個結構域的質粒，確定了TP區(qū)負責抑制PKC-δ介導的STAT1-727位磷酸化，RH區(qū)則負責抑制Importin-α5介導的STAT1、STAT2的入核;TP和RH兩個截短體單獨表達均具有和全長Pol表達類似的抑制IFN-α信號通路的效應。
　　綜上所述，本研究確認了Pol在HBV拮抗Ⅰ型干擾素效應通路方面的