乙型肝炎病毒S蛋白上調(diào)干擾素信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控分子hPIAS1的作用機(jī)制研究.pdf

1、PIAS1蛋白（protein inhibitor of activated STAT1），又稱鳥苷RNA解旋酶II結(jié)合蛋白，屬于哺乳動(dòng)物PIAS超家族成員，后者因與STAT轉(zhuǎn)錄因子家族之間相互作用而得名。早期研究發(fā)現(xiàn)，PIAS1作為 PIAS超家族的一員，其擁有家族共有的RING保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮SUMO（small ubiquitin-related modifier）E3連接酶的作用，參與細(xì)胞增殖、分化，DNA損傷及炎癥反應(yīng)等多種細(xì)

2、胞活動(dòng)。而其SAP及C末端結(jié)構(gòu)域則分別與病毒誘導(dǎo)的早期信號(hào)傳遞及干擾素下游信號(hào)放大過程有關(guān)。沉默/敲除PIAS1分子將增加干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)與機(jī)體抗感染能力。近期研究發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎（HCV）干擾素治療不應(yīng)答患者肝組織樣本中肝細(xì)胞核內(nèi) PIAS1分子（hPIAS1）較干擾素治療應(yīng)答患者及健康對(duì)照表達(dá)明顯增加。雖然乙型肝炎病毒（HBV）的致病機(jī)理與HCV不盡相同，但研究發(fā)現(xiàn)其擁有共同的炎癥信號(hào)通路及相關(guān)分子。
　　作為經(jīng)典的嗜肝病毒

3、之一，持續(xù)HBV病毒感染可進(jìn)展為肝硬化、肝癌等終末期肝病?，F(xiàn)有的治療慢性乙型肝炎（CHB）臨床藥物主要包括核苷（酸）類似物及a-干擾素，而后者在給藥者中的應(yīng)答率也僅20-30％。藥物治療療效欠佳的潛在機(jī)制正有待進(jìn)一步研究證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，干擾素治療應(yīng)答率與HBV病毒載量相關(guān)，且CHB患者干擾素應(yīng)答不良及T細(xì)胞活化失能與高HBV病毒感染有關(guān)?；颊叱霈F(xiàn)干擾素抗性的分子機(jī)制部分可能系肝炎病毒蛋白通過誘導(dǎo)炎癥調(diào)控分子，從而下調(diào)干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路

4、?；谇捌谂R床數(shù)據(jù)，我們觀察到CHB患者PegIFNa-2a治療應(yīng)答與不應(yīng)答兩組間在肝細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞中hPIAS1分子表達(dá)水平存在差異。故我們推斷HBV病毒蛋白可能誘導(dǎo)hPIAS1分子在肝臟中高表達(dá)，這可能是干擾素治療失敗的眾多原因之一。
　　為研究HBV編碼病毒蛋白是否能上調(diào)hPIAS1分子表達(dá)及探討相關(guān)的分子機(jī)制，我們進(jìn)行如下系列實(shí)驗(yàn)：首先，我們構(gòu)建了hPIAS1熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒hpias1p(-1300)LUC，

5、并在CHO及HepG2細(xì)胞系中分別與HBV病毒蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBs、cDNA-HBx及pcDNA-HBc，或pcDNA3.1對(duì)照空載共轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染β-Gal作為檢測(cè)內(nèi)參，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，在CHO及HepG2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs組的熒光素酶活性相對(duì)pcDNA3.1組熒光素酶活性分別增加2.9及3.6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs、cDNA-HBx、pcDNA-

6、HBc或pcDNA3.1，進(jìn)行qRT-PCR及western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pcDNA-HBs組hPIAS1的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于空載組。通過上述研究表明，HBs蛋白能夠通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)肝細(xì)胞中hPIAS1基因的表達(dá)。其次，我們以hpias1p(-1300)LUC質(zhì)粒為模板，構(gòu)建系列5’端缺失的啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。研究發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染HBs表達(dá)質(zhì)粒后hPIAS1啟動(dòng)子-507至-712區(qū)段（相對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）熒光素酶活性

7、顯著增強(qiáng)，該區(qū)可能與hPIAS1基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析我們認(rèn)為，TAL1:E47、Kid3、C/EBP gamma、MYOG/NFI及NFI分別為該區(qū)5個(gè)候選的可能順式作用元件。分別對(duì)hpias1p(-712)LUC進(jìn)行候選順式作用元件區(qū)定點(diǎn)突變，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHO細(xì)胞及HepG2細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染TAL1:E47、C/EBP gamma、MYOG/NFI或 NFI突變質(zhì)粒的熒光素酶活性較野生型質(zhì)粒明顯減弱。凝膠遷移試驗(yàn)（EMSA

8、）及染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)（CHIP）進(jìn)一步在體外及細(xì)胞內(nèi)證實(shí)HBs蛋白存在時(shí)，反式作用因子TAL1、E47、MYOG及NFI能特異性地與hPIAS1啟動(dòng)子順式作用元件結(jié)合。激光共聚焦試驗(yàn)同時(shí)也驗(yàn)證了HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBs后，較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組，其轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG及NFI在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增加，并出現(xiàn)核內(nèi)轉(zhuǎn)移。反之，當(dāng)我們運(yùn)用siRNA干擾TAL1、E47、MYOG及NFI的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染HBs蛋白后hPIAS1

9、啟動(dòng)子熒光素酶活性較未干擾組分別降低到64.3%,58.0%,59.9%and63.1%，而非相關(guān)對(duì)照組較之無明顯變化。上述實(shí)驗(yàn)表明共轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG及NFI是參與HBs蛋白上調(diào)hPIAS1基因的重要分子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs的HepG2細(xì)胞中炎癥相關(guān)信號(hào)通路ERK和p38MAPK磷酸化水平明顯升高，總蛋白中轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)及hPIAS1蛋白表達(dá)水平與P-ERK和P-

10、p38MAPK表達(dá)水平呈時(shí)間正相關(guān)，均在轉(zhuǎn)染后36-48小時(shí)達(dá)到峰值；核漿蛋白分離實(shí)驗(yàn)亦顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs的HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)TAL1、E47、MYOG和NFI核內(nèi)表達(dá)明顯增多，發(fā)生核轉(zhuǎn)位。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們進(jìn)一步運(yùn)用ERK及p38MAPK信號(hào)通路抑制劑PD098059和SB203580，發(fā)現(xiàn)分別使用ERK及p38MAPK通路抑制劑后的HepG2細(xì)胞pcDNA-HBs轉(zhuǎn)染組，其總蛋白TAL1、E47、MYOG和

11、NFI表達(dá)及hPIAS1的表達(dá)均不同程度減弱，且TAL1、E47、MYOG和NFI的核轉(zhuǎn)位亦減少，而使用JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125與未使用抑制劑的pcDNA-HBs轉(zhuǎn)染組上述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)無明顯變化?？傊?，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同說明HBs病毒蛋白通過活化ERK及p38MAPK信號(hào)通路，增加轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和 NFI的表達(dá)并結(jié)合特定的順式作用元件區(qū)，激活hPIAS1基因啟動(dòng)子，從而上調(diào)hPIAS1基因的表達(dá)。
　

12、　對(duì)于HBV感染者，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行western blot試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高HBV感染者，其ERK及p38MAPK信號(hào)通路磷酸化水平高于HBV檢測(cè)不到及健康對(duì)照者，其中P-ERK表達(dá)水平組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)結(jié)合激光共聚焦試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)高HBV感染者其轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和 NFI的表達(dá)亦高于HBV檢測(cè)不到者或健康對(duì)照。在對(duì)CHB患者的肝穿組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，高HBV的CHB患者肝細(xì)胞

13、核內(nèi)hPIAS1分子表達(dá)水平較HBV載量低的CHB患者或健康對(duì)照明顯增高。這些實(shí)驗(yàn)共同提示，高水平HBV感染患者體內(nèi)ERK及p38MAPK信號(hào)通路被激活，轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)增加，并且肝細(xì)胞核內(nèi)hPIAS1分子的表達(dá)也明顯增加。
　　綜合上述研究，我們發(fā)現(xiàn)HBs病毒蛋白能上調(diào)hPIAS1基因的表達(dá)，其主要是通過活化ERK及p38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)及核轉(zhuǎn)