RRSV在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的復制與表達.pdf

1、水稻齒葉矮縮病毒（ Rice ragged stunt virus,RRSV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）水稻病毒屬（Oryzavirus）的成員。RRSV基因組包含10條 dsRNA，編碼11種蛋白質(zhì)，其中包括8種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白。該病毒引起的水稻齒葉矮縮病在我國南方發(fā)病嚴重，對當?shù)氐乃旧a(chǎn)造成嚴重影響，成為我國水稻生產(chǎn)上的重要病害。
　　本文通過建立水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，制備RRSV抗血清，通過免疫熒光、

2、熒光定量PCR及Western blot檢測技術(shù)研究RRSV編碼3個非結(jié)構(gòu)蛋白（Pns6、Pns7和Pns10）及主要外殼蛋白P8的基因在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的復制與表達情況。結(jié)果表明：（1）通過原核表達制備的抗血清經(jīng)Western blot和間接ELISA的方法檢測證明其可用于病毒檢測的應(yīng)用；（2）通過免疫熒光標記RRSV Pns10，激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒粒子可以成功侵染水稻原生質(zhì)體，并可形成類似于病毒原質(zhì)的組分，該組分隨著侵染時

3、間的延長而逐漸發(fā)生聚集；（3）利用熒光定量PCR技術(shù)，通過對病毒侵染水稻原生質(zhì)體不同時間段進行動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，在接種病毒后的60 h內(nèi)，RRSV各檢測基因在8 h時開始積累，后均呈上升趨勢，表達非結(jié)構(gòu)蛋白的S6、S7、S10在24 h左右mRNA表達量達到最大值，表達CP的S8基因在32 h左右增值達到最大值，此后表達量均開始下降，但仍保持在較高水平，該結(jié)果表明在病毒侵染水稻原生質(zhì)體細胞24-32 h時達到復制轉(zhuǎn)錄高峰期；（4）以制備的R

4、RSV抗血清為探針，通過Western blot檢測到病毒侵染原生質(zhì)體后，非結(jié)構(gòu)蛋白Pns7和Pns10在12 h開始表達，在32 h左右達到最大值，結(jié)構(gòu)蛋白P8在24 h開始表達，在48 h左右達到最大值，表明非結(jié)構(gòu)蛋白先于外殼蛋白表達，RRSV粒體在侵染水稻原生質(zhì)體24 h開始增殖，48 h左右達到最大值；（5）通過煙草的瞬時表達體系表達RRSV4個目的基因和YFP的融合蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光在煙草細胞中的分布，發(fā)現(xiàn)