大鼠—大鼠雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的優(yōu)化及HIV病毒P24抗原特異性大鼠單抗的建立與應(yīng)用.pdf

1、自上世紀(jì)60年代出現(xiàn)基于骨髓瘤的單克隆抗體制備技術(shù)以來，單克隆抗體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已獲得廣泛應(yīng)用，既可以作為研究工具，也可以應(yīng)用于疾病的診斷與治療。最常見的單克隆抗體制備技術(shù)是基于小鼠-小鼠雜交瘤的小鼠單抗制備技術(shù)。近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，小鼠單抗制備技術(shù)逐漸暴露出自身的局限性，如:對小鼠源抗原的反應(yīng)性較弱、對部分人源抗原的抗體親和力較低等，因此，開發(fā)非小鼠種屬來源的新型單抗制備技術(shù)成為一個新的研究方向，包括基于大鼠-大鼠雜交瘤的

2、大鼠單抗制備技術(shù)、基于家兔雜交瘤技術(shù)的兔單抗制備技術(shù)等。本研究以大鼠單抗制備技術(shù)為研究對象，首先，通過優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)室前期建立的大鼠單抗制備方法，解決了影響大鼠單抗制備穩(wěn)定性的關(guān)鍵影響因素，建立起穩(wěn)定的大鼠單抗制備技術(shù);然后，應(yīng)用大鼠單抗技術(shù)研制針對HIV病毒衣殼蛋白(P24)的大鼠單抗;最后，探索抗-P24大鼠單抗在HIV診斷試劑開發(fā)中的應(yīng)用潛能。具體研究結(jié)果如下:
　　 首先，優(yōu)化大鼠單抗制備技術(shù)。通過分析本實(shí)驗(yàn)室前期建立的大鼠

3、-大鼠雜交瘤單抗制備技術(shù)存在的技術(shù)瓶頸問題，確定融合率、融合檢測方式、克隆化方式以及腹水誘導(dǎo)成功率等影響大鼠單抗技術(shù)推廣應(yīng)用的關(guān)鍵問題作為首選的優(yōu)化對象。結(jié)果顯示:(1)膽固醇是影響大鼠-大鼠雜交瘤融合成功率的關(guān)鍵因素，通過在培養(yǎng)基中添加游離膽固醇，融合率可由原來的44.76％左右穩(wěn)定提高到93.25％左右，建立起穩(wěn)定的大鼠雜交瘤融合方法;(2)未融合B細(xì)胞的凋亡時間是影響融合檢測特異性的影響因素，通過兩次換液延長融合檢測間隔時間，顯著

4、降低了融合檢測本底，建立了優(yōu)化的融合檢測方法;(3)大鼠骨髓瘤細(xì)胞的成集落特性是影響雜交瘤單克隆化的關(guān)鍵影響因素，通過比較多種克隆化方法，最終確定改良的有限稀釋法作為最佳的大鼠雜交瘤克隆化方法，提高了獲得大鼠單克隆雜交瘤的成功率。(4)大鼠雜交瘤細(xì)胞在LOU/CN大鼠腹腔內(nèi)的腹水誘導(dǎo)成功率與大鼠融合伴侶細(xì)胞YB2/0是否適應(yīng)LOU/CN大鼠腹腔有關(guān)，通過將YB2/0細(xì)胞導(dǎo)入LOU/CN大鼠腹腔反復(fù)馴化，顯著提高了YB2/0細(xì)胞在LOU/

5、CN大鼠腹腔內(nèi)的適應(yīng)性，使大鼠雜交瘤細(xì)胞的單抗腹水誘導(dǎo)成功率從原來的49.25％提高到93.25％。
　　 其次，利用優(yōu)化后的大鼠-大鼠雜交瘤技術(shù)制備出53個抗HIV病毒衣殼蛋白大鼠單抗(anti-P24rat-mAb)，通過單抗的配對篩選，發(fā)現(xiàn)兩株大鼠單抗13F8和15A2作為捕獲單抗能夠與商品化試劑盒中的標(biāo)記單抗形成最佳配對，不僅靈敏度高且降低了假陽性血清的反應(yīng)性。上述單抗為進(jìn)一步改良第四代HIV診斷試劑盒提供了重要的候選原