組成型表達幾丁質(zhì)酶Bt519-1工程菌株的構建及應用評價.pdf

1、如今，對Bt(Bacillus thuringiensis)野生型菌株的改造成為研究熱點，國內(nèi)外有報道構建Bt工程菌株的實例，大多數(shù)都是利用芽胞期依賴型cry基因的強啟動子與結構基因一起構建融合基因，而利用幾丁質(zhì)酶chi基因自身的強啟動子的范例甚少。尋找一個能夠在營養(yǎng)期組成型且高效的chi基因啟動子，不僅可以打破芽胞期表達的局限，而且可以提高幾丁質(zhì)酶的表達量，可謂一舉兩得。利用這樣的啟動子來提高Bt制劑的生防效果，達到殺蟲毒力較高、抑真

2、菌效果好、重組工程菌株遺傳性狀穩(wěn)定等目的，成為本研究的創(chuàng)新所在。
　　本研究一方面從幾丁質(zhì)酶基因表達調(diào)控分子機制的探索入手，以其營養(yǎng)期啟動子操縱區(qū)域的dre位點為研究材料，通過堿基定點置換技術研究dre位點對幾丁質(zhì)酶表達類型的影響，確定dre位點在基因表達調(diào)控過程中的重要功能。另一方面，從組成型啟動子中選取啟動活性最高效的作為構建工程菌株的啟動子，進而利用分子生物學手段構建組成型表達幾丁質(zhì)酶Bt工程菌株，并對工程菌生防應用潛能進行

3、進一步的評價，為有針對性地進行芽胞桿菌的定向分子育種提供實例。
　　本研究Bti75幾丁質(zhì)酶基因chiB啟動子操縱區(qū)含有一個16bp(-112～-97位)的回文序列，稱為dre位點(DasR蛋白應答元件)。對該區(qū)域所有堿基位點進行定點置換后，結果發(fā)現(xiàn)與對照啟動子（-504～-89位）相比，在此基礎上-99/-98位TC→GA、-102位A→C、-103位G→T、-109位C→A、-111/-110位GA→AG堿基的置換都使啟動子在

4、不誘導條件下啟動的β-半乳糖苷酶的活性有所上升，其中-109位點置換后酶活上升得最高，是對照啟動子啟動酶活力的11倍，是全長啟動子的3.3倍;而-108、-101、-105、-104四個位點的堿基置換后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在誘導和不誘導條件下酶活很低，推測該四個堿基位點與阻遏物的結合緊密程度有關;其他堿基位點-97、-100、-106、-107、-112位雖然沒有改變酶的表達類型，仍然是誘導型，但是酶的表達量發(fā)生了改變，有所上升或下降。上述結果

5、證明chiB啟動子操縱區(qū)dre位點在幾丁質(zhì)酶表達類型的調(diào)控中起重要作用，同時也達到了獲得組成型高效啟動子的目的。
　　本研究成功構建一株幾丁質(zhì)酶活性較野生菌提高3～3.5倍的工程菌株Bt519-1(pDM)，實現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶ChiMY75的異源表達。對工程菌的特性研究表明重組質(zhì)粒在工程菌株的發(fā)酵過程中能比較穩(wěn)定地傳代，四天后質(zhì)粒保存率仍能達到90％以上。兩株菌發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，發(fā)現(xiàn)了一條大約67kD的特異蛋白條帶，

6、酶譜分析實驗進一步證實，該特異表達蛋白條帶是幾丁質(zhì)酶。
　　對于工程菌株的應用評價首先在平板上進行抑菌譜的初篩，比較菌株對10種植物病原真菌活性的差異。抑菌譜初篩實驗證明幾丁質(zhì)酶能夠增強野生型菌株的抑菌效果，改造后的工程菌對辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌和馬鈴薯晚疫病菌的抑制效果提升幅度較大，其中效果最顯著的是辣椒疫霉病菌。另外，從初篩結果中亦發(fā)現(xiàn)野生菌株對油菜菌核病菌（核盤菌）的抑制率能達到100％，說明Bt519-1體內(nèi)存在的某種

7、抑菌物質(zhì)能夠高效拮抗核盤菌。
　　選取兩種對Bt敏感型真菌——辣椒疫霉病菌和油菜菌核病菌作為盆栽防效評估實驗的供試真菌，結果表明對辣椒疫霉病菌的防治上，工程菌發(fā)酵粗酶液前七天的防效最好，達到73％，比野生型提高了38％，并且持續(xù)時間長，于第十天與野生型的防效差別最顯著。油菜菌核病病葉率的溫室防效結果表明，Bt519-1與Bt519-1(pDM)發(fā)酵上清液分別能減少44.6％和58.4％的疾病發(fā)生率。另外，工程菌的IC50比野生型降