可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑經(jīng)微小RNA-1調(diào)節(jié)PI3K通路機制的研究.pdf

1、目的:
　　1.研究可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolaseinhibitor sEHi)t-AUCB(trans-4-[4-(3-adamantan-1-yl-ureido)-cyclohexyloxy]-bensoic acid)干預(yù)對原代乳小鼠心肌細胞心肌缺血模型中內(nèi)向整流型鉀電流(IK1)幅度的影響。
　　2.探討t-AUCB調(diào)控微小RNA-1（microRNA-1 miR-1）

2、機制，明確miR-1參與PI3K通路的調(diào)控。
　　方法:
　　體外部分:
　　選取出生1天的昆明小鼠乳鼠，培養(yǎng)原代心肌細胞，分5組進行不同的干預(yù):(1)空白對照組(Ctl);(2) micrONTM mmu-miR-1a-3pagomir(agomiR-1)轉(zhuǎn)染組(agomiR-1);(3)agomiR-1轉(zhuǎn)染+t-AUCB干預(yù)組（agomiR-1+t-AUCB）;(4) micrONTM mmu-miR-1a-3p

3、agomirnegative control組(Neg Ctl);(5)agomiR-1轉(zhuǎn)染+DMSO干預(yù)組(agomiR-1+DMSO)。最后以全細胞模式記錄鉀電流(IK1)。
　　體內(nèi)部分:
　　1.8周雄性昆明小鼠分成5組:(1)飲用水+假手術(shù)組(飲用水+sham);(2)飲用水+心肌梗死組（飲用水+MI）;(3) t-AUCB0.2mg/L+心肌梗死組(t-AUCB0.2mg/L+MI);(4) t-AUCB1mg/

4、L+心肌梗死組(t-AUCB1 mg/L+MI);(5)t-AUCB5mg/L+心肌梗死組(t-AUCB5mg/L+MI)。24小時后取出心梗后缺血區(qū)心肌，運用Western Blot檢測缺血區(qū)心肌p-AKT、p-GSK3β的表達。
　　2.8周雄性昆明小鼠，用含t-AUCB5mg/L飲用水喂養(yǎng)7天，建立心梗模型后以尾靜脈注射轉(zhuǎn)染agomiR-1或陰性對照物agomiR-1Neg Ctl，具體分組如下:(1)飲用水+假手術(shù)組（飲用

5、水+sham）;(2)飲用水+心肌梗死組（飲用水+MI）;(3)飲用水+心肌梗死組+agomiR-1組（飲用水+MI+agomiR-1）;(4)飲用水+心肌梗死+agomiR-1 Neg Ctl組（飲用水+MI+ Neg Ctl）;(5) t-AUCB5mg/L+心肌梗死組(t-AUCB5mg/L+MI);(6) t-AUCB5mg/L+心肌梗死+agomiR-1組(t-AUCB5mg/L+MI+ agomiR-1)。24小時后取出心梗

6、后缺血區(qū)心肌，運用Western Blot檢測缺血區(qū)心肌p-AKT、p-GSK3β蛋白的表達。
　　3.8周雄性昆明小鼠，用含t-AUCB5mg/L飲用水喂養(yǎng)7天，建立心梗模型后以尾靜脈注射或腹腔注射PI3K抑制劑wortmannin，具體分組如下:(1)飲用水+假手術(shù)組（飲用水+sham）;(2)飲用水+心肌梗死組（飲用水+MI）;(3) t-AUCB5mg/L+心肌梗死組(t-AUCB5mg/L+MI);(4) t-AUCB5

7、mg/L+心肌梗死+wortmannin0.3mg/kg（尾靜脈注射）(t-AUCB5mg/L+MI+0.3W[尾]）;(5) t-AUCB5mg/L+心肌梗死+wortmannin0.3mg/kg（腹腔注射）(t-AUCB5mg/L+MI+0.3W[腹腔]）。24小時后取出心梗后缺血區(qū)心肌，運用Real-time PCR檢測缺血心肌KCNJ2，GJA1 mRNA的變化。
　　結(jié)果
　　體外部分:
　　1.所測電流的I

8、-V曲線隨著電壓增加，其電流偏向于X軸，符合內(nèi)向整流型鉀電流的特點。
　　2.在-100mV，正常對照組的IKI電流密度為-4.62±0.24pA/pV。
　　3.使用miR-1激動劑agomiR-1200nM轉(zhuǎn)染心肌細胞以模擬心肌缺血狀態(tài)，在-100mV時，IK1電流密度為-0.05±0.06 pA/pV，與正常對照組相比明顯減小，差異具有顯著性(n=6，p＜0.05)。
　　4.使用miR-1激動劑agomiR-1

9、轉(zhuǎn)染心肌細胞48小時后再使用10μM的t-AUCB干預(yù)心肌細胞，在-100mV時，IK1電流大小為-2.71±0.12 pA/pV，與miR-1過表達組相比，IK1電流密度顯著增大，表示藥物干預(yù)具有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，p＜0.05)。
　　5.使用agomiR-1 NC干預(yù)組，在-100mV時，IK1電流大小為-3.94±0.27 pA/pV，與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(n=6，p＞0.05)。
　　6.使用miR-1激動

10、劑agomir miR-1200nM轉(zhuǎn)染心肌細胞48小時后再使用DMSO干預(yù)組，在-100mV時，IK1電流密度為-0.16±0.04pA/pV，與miR-1過表達組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(n=6，p＞0.05)。
　　體內(nèi)部分:
　　1.飲用水+MI組的p-AKT、p-GSK3β表達水平較飲用水+sham組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，p＜0.05)。
　　2.t-AUCB能夠濃度依賴性地增加心梗后缺血心肌中p-A

11、KT、p-GSK3β表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，p＜0.05)。
　　3.尾靜脈注射miRNA-1激動劑agomiR-1后p-AKT、p-GSK3β水平進一步下降，5mg/L t-AUCB能夠拮抗agomir miRNA-1的上述作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，p＜0.05)。
　　4.t-AUCB5mg/L干預(yù)后能使小鼠心臟缺血區(qū)心肌組織KCNJ2、GJA1 mRNA的表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，p＜

12、0.05)。尾靜脈注射或腹腔注射PI3K抑制劑wortmannin能拮抗t-AUCB處理使小鼠心臟缺血區(qū)組織的KCNJ2、GJA1 mRNA表達增加的影響(n=6，all p＜0.05)。
　　結(jié)論
　　體外部分:
　　1.miR-1過表達時IK1電流密度明顯減小。
　　2.t-AUCB能逆轉(zhuǎn)miR-1過表達所致的IK1電流密度的改變。
　　結(jié)合前期證實: t-AUCB通過調(diào)控miR-1作用于靶基因KCNJ

13、2而引起IK1電流的改變。
　　體內(nèi)部分:
　　1.心肌梗死后小鼠缺血區(qū)心肌組織的p-AKT，p-GSK3β表達下降。
　　2.t-AUCB能夠濃度依賴性地上調(diào)缺血區(qū)心肌組織的p-AKT，p-GSK3β表達。
　　3.miR-1過表達試劑agomiR-1通過尾靜脈注射能使小鼠心臟缺血區(qū)組織的p-AKT，p-GSK3β表達進一步下降，而t-AUCB能夠拮抗miR-1過表達所引起的上述改變。
　　4.t-AUC