大鼠短暫局灶性腦缺血后Cathepsin B介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與JNK信號(hào)通路的關(guān)系及法舒地爾對(duì)其干預(yù)的研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò) ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾(ROCK選擇性的抑制劑)對(duì)缺血/再灌注模型的干預(yù)以及檢測(cè)和分析cathepsin B與p-JNK之間的蛋白表達(dá)的變化、定位的關(guān)系,探討溶酶體組織蛋白酶的促凋亡的分子機(jī)制和法舒地爾的藥理抗凋亡的分子機(jī)制,可能為缺血性腦卒中的防治提供了新的理論依據(jù)和新的治療方向,有著重要的臨床意義。
　　方法：
　　清潔級(jí)健康雄性10-12周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠72

2、只,體重約270±20g,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham,n=6)、模型組0h(M-0h, n=6)、模型組2h(M-2h,n=6)、模型組6h(M-6h,n=6)、模型組24h(M-24h,n=6)、模型組48h(M-48h,n=12)、干預(yù)組2h(I-2h, n=6)、干預(yù)組6h(I-6h,n=6)、干預(yù)組24h(I-24h,n=6)和干預(yù)組48h(I-48h,n=12)。線栓法制備MCA局灶性缺血再灌注模型。干預(yù)組給予鹽酸法舒地爾注射

3、液5mg/kg,每12h一次,從缺血再灌注0h起給予腹腔注射,直至斷頭取腦;模型組在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予等量的生理鹽水。利用Longa的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損變化;運(yùn)用TTC染色法、TUNEL法和免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法,分別檢測(cè)腦梗死體積變化、視前區(qū)細(xì)胞凋亡變化和視前區(qū)cathepsin B與p-JNK蛋白表達(dá)變化;通過(guò)使用雙變量相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)方法和免疫熒光雙標(biāo)激光共聚焦檢測(cè)法來(lái)分析cathepsin B和p-JNK蛋白表達(dá)的相關(guān)性和這兩

4、種蛋白的定位關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.模型成功率為86.84％;模型組48h相對(duì)梗死體積的變異系數(shù)為3.89%。
　　2.假手術(shù)組未見梗死灶,模型組及干預(yù)組缺血側(cè)皮層及皮層下出現(xiàn)白色的梗死灶;模型組48h相對(duì)梗死體積為28.52±1.11%,但干預(yù)組的相對(duì)腦梗死體積為13.43±0.86%,較模型組明顯減少(P<0.05),其神經(jīng)功能評(píng)分也得到明顯改善(P<0.05)。
　　3.在大鼠缺血側(cè)視前區(qū),假手術(shù)組基本

5、看不到凋亡細(xì)胞,模型組2h可觀察到細(xì)胞凋亡,6h增多,24h達(dá)高峰,48h有所下降(P<0.001);鹽酸法舒地爾明顯減少缺血再灌注后的凋亡細(xì)胞(P<0.001)。
　　4.在大鼠缺血側(cè)視前區(qū),假手術(shù)組未見明顯 cathepsin B免疫活性表達(dá);再灌注開始就可見cathepsin B蛋白表達(dá),2h明顯增加,6h達(dá)到高峰,24h降到最低,48h又有所增加(P<0.001);鹽酸法舒地爾干預(yù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的cathepsin B蛋白表

6、達(dá)較模型組無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　5.在大鼠缺血側(cè)視前區(qū),假手術(shù)組未見任何p-JNK陽(yáng)性表達(dá);模型組再灌注開始未見p-JNK的蛋白表達(dá),再灌注2h可觀察到p-JNK陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),6h達(dá)到頂峰,再灌注24h降到最低,48h也有所增加( P<0.001);鹽酸法舒地爾可以明顯抑制 p-JNK免疫活性表達(dá)(P<0.05);干預(yù)組的p-JNK蛋白表達(dá)再灌注6h比2h還是有增高的趨勢(shì),24h降低(P<0.05),再灌注48h與24

7、h相比變化不大(P>0.05)。
　　6.免疫熒光雙標(biāo)顯示:在缺血側(cè)視前區(qū)缺血再灌注后cathepsin B和p-JNK表達(dá)共定位于再灌注2h、6h、24h和48h,而再灌注開始時(shí)只觀察到少量cathepsin B陽(yáng)性細(xì)胞,并未見到p-JNK蛋白表達(dá);再灌注6h兩種蛋白共染的細(xì)胞數(shù)量明顯增多并達(dá)到頂峰,隨后下降至再灌注24h,再灌注48h又有所增加(P<0.001)。
　　7.雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示:在缺血側(cè)視交叉前區(qū)缺血再