TLR4活化促進肝癌細(xì)胞侵襲活性的研究.pdf

1、肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤,死亡率僅次于胃癌、食道癌,占全世界癌癥死亡的第三位。肝癌占我國癌癥死因的第二位,我國每年約11萬人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。肝癌晚期患者因癌細(xì)胞擴散而治愈率較低,手術(shù)切除后肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高達(dá)75％。肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移可能是肝癌治療失敗和患者致死的主要原因,而腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜的生物學(xué)過程,所以研究肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機制對肝癌細(xì)胞的防治非常重要。
　　 目的:本實驗主要探討Toll樣

2、受體(TLR)4信號活化后對肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、Hep3B的體外侵襲活性的影響。同時檢測TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多個信號分子的活化狀態(tài)或磷酸化水平,并加入相關(guān)分子抑制劑,以明確該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在TLR4促進腫瘤細(xì)胞侵襲中的作用。旨在闡明肝癌細(xì)胞內(nèi)TLR4信號活化與肝癌細(xì)胞侵襲活性間的相關(guān)性,為今后肝癌防治提供了潛在的作用靶點。
　　 方法:利用熒光定量PCR檢測TLR4、MMP2、MMP9在HepG2、SMMC7

3、721、Hep3B細(xì)胞中mRNA的表達(dá)情況。在1μg/mlLPS刺激不同時間后,用熒光定量PCR方法檢測TLR4、MMP2、MMP9mRNA水平的變化,同時用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測TLR4蛋白水平的變化。用蛋白印跡法(westernblot)檢測LPS刺激后JNK、IκBα和pNF-κB的磷酸化水平變化以及NF-κB核轉(zhuǎn)位的變化。用劃痕實驗檢測這幾種細(xì)胞的侵襲活性,并用transwell方法檢測LPS刺激后細(xì)胞體外侵襲活性的改變。觀

4、察JNK抑制劑SP600125能否抑制細(xì)胞的體外侵襲活性以及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活化。
　　 結(jié)果:
　　 1.HepG2、SMMC7721、Hep3B細(xì)胞均表達(dá)一定水平的TLR4、MMP(Matrixmetalloproteinase,MMP)2以及MMP9。
　　 2.LPS刺激后HepG2、SMMC7721、Hep3B細(xì)胞的TLR4mRNA和蛋白水平均升高,同時MMP(Matrixmetalloprotein

5、ase,MMP)2、MMP9的mRNA水平亦增加。
　　 3.LPS刺激可以促進肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、Hep3B侵襲活性增加。
　　 4.LPS刺激后信號分子JNK,IκB以及NF-κB的磷酸化程度增高,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的核轉(zhuǎn)位增加,而p-ERK,p-p38水平無明顯變化。
　　 5.加入JNK抑制劑SP600125后,肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、Hep3B的侵襲能力降低。