MiR-18a靶向Dicer1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲遷移.pdf

1、背景和目的：
　　微小 RNA(microRNA,miRNA)是一類大小約22個(gè)核苷酸的保守非編碼RNA,能夠與下游靶基因mRNA的3’UTR堿基配對(duì)并引導(dǎo)基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯,參與生物合成和腫瘤的發(fā)展。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。迄今為止,

2、對(duì)肝細(xì)胞癌組織進(jìn)行miRN A分子差異表達(dá)譜分析的研究也十分有限。目前已有研究表明miR-18a在肝癌組織的表達(dá)水平較癌旁正常組織高。我們前期研究結(jié)果顯示肝癌患者血清中miR-18a水平較健康人高。本課題擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討miR-18a對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響并闡明其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將miR-18a阻遏物(inhib itor),miR-18a阻遏物陰性對(duì)照組(inhibitor n

3、egative control,inhibitor NC)分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2及HepG2.2.15。通過(guò)transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　2、生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)Dicer1為miR-18a的靶基因。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法分別將靶向沉默Dicer的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)與miR-18a inhibito

4、r共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2及HepG2.2.15,并設(shè)置Dicer siRNA的陰性對(duì)照(negative control siRNA,siRNANC)與miR-18a inhibitor共轉(zhuǎn)染為對(duì)照組,以及miR-18a inhibitor組、inhibitor NC對(duì)照組,transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,transwell遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,westem blot檢測(cè)Dicer l蛋白表達(dá),觀察miR-

5、18a對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響是否通過(guò)抑制Dicer1表達(dá)發(fā)揮。
　　結(jié)果：
　　1、Tra ns we ll侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染miR-18a inhib itor72h后,HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著降低,平均每高倍視野(×200)侵出小室的細(xì)胞數(shù)與NC組相比均顯著減少,HepG2細(xì)胞miR-18a inhibitor組分別為NC組的0.410倍、0.446倍(P<0.

6、01);HepG2.2.15細(xì)胞miR-18ainhibitor組分別為NC組的0.565倍、0.602倍(P<0.01)。
　　劃痕實(shí)驗(yàn)顯示HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞劃痕后24h、48h、72h,miR-18ainhibitor組劃痕愈合速度明顯慢于NC組(均 P<0.05)。
　　2、Western blot檢測(cè)及transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染inhibitorNC組相比,轉(zhuǎn)染miR-18ai

7、nhibitor組48h后細(xì)胞中Dicer1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),transwell顯示細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著減弱,平均每高倍視野(×200)侵出小室的細(xì)胞數(shù)與NC組相比均顯著減少,HepG2細(xì)胞miR-18ainhibitor組分別為NC組的0.462倍、0.460倍(P<0.01);HepG2.2.15細(xì)胞miR-18ainhibitor組分別為NC組的0.574倍、0.579倍(P<0.01)。與共轉(zhuǎn)染siRNA

8、NC+miR-18ainhibitor組相比,共轉(zhuǎn)染DicersiRNA+miR-18ainhibitor48h后細(xì)胞中Dicer1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),同時(shí)transwell顯示細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著增強(qiáng),平均每高倍視野(×200)侵出小室的細(xì)胞數(shù)與siRNA-NC+miR-18ainhibitor組相比均顯著增多,HepG2細(xì)胞DicersiRNA+miR-18ainhibitor組分別為siRNA-NC+miR-

9、18ainhibitor組的2.079倍、2.193倍(P<0.01);HepG2.2.15細(xì)胞DicersiRNA+miR-18ainhibitor組分別為siRNA-NC+miR-18ainhibitor組的1.619倍、1.777倍(P<0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞劃痕后24h、48h、72h,共轉(zhuǎn)染DicersiRNA+miR-18ainhibitor組劃痕愈合速度明顯快于siRNANC+miR-