TLR4信號通路參與人肺癌細(xì)胞免疫逃逸機制的研究.pdf

1、本課題的主要目的是探討人肺癌細(xì)胞表面TLRs的表達(dá)和在相應(yīng)配體作用下人肺癌細(xì)胞表達(dá)與免疫逃逸相關(guān)的因子及其可能的機理。 本研究發(fā)現(xiàn)，來源于不同組織的人類腫瘤細(xì)胞株表面普遍表達(dá)TLRs，檢測了人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB231，人肺癌細(xì)胞株H1299、A549，人淋巴細(xì)胞瘤KG-1、Raji細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其表面均表達(dá)TLRs，特別是普遍表達(dá)TLR4、TLR9。選取了高表達(dá)TLR4的人肺癌細(xì)胞H1299、A549作為模型細(xì)胞

2、，用TLR4配體LPS作為激活劑，觀察TLR4活化后人肺癌細(xì)胞的生物學(xué)活性的變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人肺癌細(xì)胞株H1299和A549可以自發(fā)分泌一定水平的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，經(jīng)LPS刺激后，人肺癌細(xì)胞H1299和A549分泌TGF-β和VEGF的水平顯著升高；此外，LPS刺激還可以顯著增加A549細(xì)胞的IL-8分泌量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS預(yù)先刺激后，人肺癌細(xì)胞株H1299和A549對TNF-

3、α、TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抵抗作用。近年來大量文獻(xiàn)報道腫瘤細(xì)胞來源的TGF-β和VEGF可通過抑制樹突狀細(xì)胞的的成熟和功能、誘導(dǎo)抑制性或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生從而逃逸機體免疫系統(tǒng)的攻擊，我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR4活化信號可以促進(jìn)人肺癌細(xì)胞分泌免疫抑制性細(xì)胞因子TGF-β、VEGF并顯著提高人肺癌細(xì)胞對凋亡的抵抗作用，表明TLR4信號活化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃逸機體的免疫攻擊，有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 對LPS促進(jìn)人肺癌細(xì)胞免疫抑制性細(xì)胞因

4、子的分泌和凋亡抵抗作用的可能的機制進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人肺癌細(xì)胞株H1299和A549在LPS的刺激下TLR4經(jīng)典的信號傳導(dǎo)途徑被活化，引起MAPKs激酶中p38信號分子的磷酸化升高，而MAPKs中另二個常見激酶ERK1/2和JNK1/2在未受LPS刺激的H1299和A549細(xì)胞中的磷酸化水平本身就較高，在LPS刺激不同時間后其磷酸化水平并沒有明顯變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p38激酶特異性抑制劑SB203580可以抑制LPS誘導(dǎo)的H129

5、9和A549細(xì)胞分泌VEGF及IL-8的升高而對于TGF-β的分泌沒有明顯影響，表明TLR4活化信號刺激腫瘤細(xì)胞上調(diào)分泌VEGF、IL-8與p38激酶途徑的活化密切相關(guān)，p38激酶也許是腫瘤細(xì)胞中TLR4活化后下游途徑的一個重要環(huán)節(jié)。 檢測了LPS刺激后人肺癌細(xì)胞H1299和A549中NF-κB途徑的活化情況。利用NF-κB報告基因檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后H1299和A549中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯增強，而且隨著LPS刺激時間

6、延長而增加。分別檢測了胞漿內(nèi)和胞核內(nèi)NF-κB蛋白的量、IκBa的磷酸化情況，證實了在LPS刺激后H1299和A549細(xì)胞中I-κB的磷酸化增加、NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)位。結(jié)果表明了LPS可以誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞H1299和A549中NF-κB途徑的活化。為了進(jìn)一步闡明NF-κB途徑的活化與LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的分泌增加和凋亡抵抗的相關(guān)性，使用了NF-κB的特異性抑制劑PDTC抑制NF-κB的作用，發(fā)現(xiàn)其對人肺癌細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子沒有影響，而對L

7、PS誘導(dǎo)的凋亡抵抗效應(yīng)有明顯的抑制作用，可以恢復(fù)TNF-a、TRAIL誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。此外，檢測了肺癌細(xì)胞株H1299、A549胞內(nèi)的Akt和STAT3的變化，發(fā)現(xiàn)在LPS刺激不同時間后Akt磷酸化水平隨之而改變，而Ser磷酸化的STAT3也隨著LPS刺激而升高，這兩者的升高和肺癌細(xì)胞對凋亡的抵抗也許存在著相關(guān)性，這需要進(jìn)一步實驗證實。 總之，本研究發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞H1299和A549上組成性表達(dá)TLR4受體，LPS刺激可以促