綿羊臍帶和羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Msenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs存在于動物胎兒和成體多種組織中，目前已經(jīng)從多個物種的多種組織中提取分離出MSCs，而研究最多的MSCs主要是骨髓源的MSCs。
　　本研究以綿羊臍帶和羊水組織為材料來源，分別采用酶消化法和離心分離法培養(yǎng)獲得目的細(xì)胞，并大量凍存了第三代的細(xì)胞。然后，以第五代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，對得到的細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生長性能、表面

2、標(biāo)志等方面的鑒定，最后，進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨的誘導(dǎo)分化，驗(yàn)證其多能性。結(jié)果顯示分離得到的細(xì)胞形態(tài)均一，呈現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，增殖能力旺盛，在體外傳代培養(yǎng)至20代時細(xì)胞仍然保持良好的生物學(xué)性狀;傳代至第20代時，仍具有正常二倍體核型(2n=54);免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)記CD13、CD29、CD44、CD90和CD106，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志基因CD45。結(jié)果表明本研究分離得到的細(xì)胞具備MSCs的生物學(xué)特性。進(jìn)一步通過細(xì)胞染

3、色及實(shí)時定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了其體外誘導(dǎo)分化能力，結(jié)果顯示:成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞經(jīng)油紅-O染色可見明顯脂滴，RT-PCR顯示成脂細(xì)胞特異性基因硬脂酰CoA去飽和酶(SCD)、過氧化物酶體增殖物激活受體G(PPARG)表達(dá)呈陽性;成骨誘導(dǎo)后，經(jīng)AgN03染色后可見鈣鹽沉積，實(shí)時定量PCR顯示成骨細(xì)胞特異性基因膠原蛋白Ⅰ(BGLAP)表達(dá)呈陽性;成軟骨誘導(dǎo)后，經(jīng)阿利新藍(lán)染色后呈藍(lán)色，PCR顯示成軟骨特異基因光蛋白聚糖(LUM)和雙鏈蛋白聚糖(BG