臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化.pdf

1、目的:
　　 1.從臍帶中分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),并研究其形態(tài)、分子表型和分化能力等基礎(chǔ)特征。
　　 2.研究低氧環(huán)境、青霉素和鏈霉素及血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)增殖、凋亡和胞外基質(zhì)(ECM)成分基因表達(dá)的影響,尋找最適培養(yǎng)條件,并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.用酶消化法從臍帶中分離出單個(gè)細(xì)胞,貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)、純化;顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

2、;MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,并繪制生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志;分別用成骨、成軟骨和成脂肪誘導(dǎo)劑予以誘導(dǎo),并通過(guò)堿性磷酸酶(ALP)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色、油紅O染色進(jìn)行分化能力鑒定。
　　 2.取穩(wěn)定增殖的UC-MSC,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,分別置于低氧和常氧條件下培養(yǎng),分別在24h、48h以MTT法檢測(cè)兩組UC-MSC增殖情況,2d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組UC-MSC表面抗原表達(dá)情況,24h后實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(rea

3、l-timeQ-PCR)法檢測(cè)兩組UC-MSC中ECM和凋亡相關(guān)基因(bcl-2,bax)的cDNA表達(dá)情況。
　　 3.將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分為對(duì)照組、青霉素組和鏈霉素組培養(yǎng),其中對(duì)照組不加抗生素,青霉素組與鏈霉素組各分為100、500和1000 U/mL三個(gè)濃度組,培養(yǎng)24h后以MTT法檢測(cè)各組UC-MSC增殖情況,培養(yǎng)12h后以real-time Q-PCR法檢測(cè)各組UC-MSC中ECM和bcl-2、bax的cDNA表達(dá)情況

4、。
　　 4.將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,其中對(duì)照組不加PDGF,實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度(2、5、10、20、50ng/mL)的PDGF,加入PDGF24h后,以MTT法檢測(cè)各組UC-MSC增殖情況,加入PDGF12h后,以real-time Q-PCR法檢測(cè)各組UC-MSC中ECM和bcl-2、bax的cDNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.從入臍帶中分離出的貼壁細(xì)胞主要表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞

5、,呈平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng);細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD73、CD166和CD44陽(yáng)性表達(dá),CD29陽(yáng)性表達(dá)率為47.45％,CD34、CD45和CD31陰性表達(dá);在外來(lái)誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下,臍帶中分離得到的細(xì)胞可向成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化。
　　 2.培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,低氧組UC-MSC的OD值及克隆形成率明顯高于常氧組;兩組UC-MSC表面抗原的表達(dá)總體無(wú)明顯差異,低氧組CD105陽(yáng)性表達(dá)率略高于常氧組;低氧組UC

6、-MSC中ECM成分的表達(dá)較常氧組有所增加;bcl-2與bax在低氧條件下表達(dá)均上調(diào),但bcl-2的上調(diào)程度較bax更明顯。
　　 3.低濃度的青霉素和鏈霉素作用下,UC-MSC的OD值明顯升高,濃度為100U/mL時(shí)OD值最高;同時(shí)青鏈霉素能降低其ECM成分的表達(dá),且抗生素濃度越高,ECM表達(dá)降低越多;低濃度的青鏈霉素能提高bcl-2/bax的cDNA表達(dá)比值。
　　 4.隨著PDGF濃度的增加,細(xì)胞OD值逐漸增加,且

7、PDGF在20ng/mL濃度時(shí)達(dá)到最高值,但PDGF濃度為50ng/mL時(shí)OD值反而降低;PDGF為2ng/mL時(shí),ECM成分表達(dá)和bcl-2/bax比值較對(duì)照組有所降低,隨著PDGF濃度的增加,ECM的表達(dá)和bcl-2/bax比值呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),且在10ng/mL時(shí)達(dá)到最高值。
　　 結(jié)論:
　　 1.從臍帶中成功分離培養(yǎng)的細(xì)胞,具有MSCs生物學(xué)特性。
　　 2.在UC-MSC的體外培養(yǎng)中,低氧環(huán)境能