人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外向黑素細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、目的:建立體外分離培養(yǎng)獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells，hADSCs)的方法，并對其形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)特性進(jìn)行觀察和研究;建立體外誘導(dǎo)hADSCs分化為黑素細(xì)胞的方法。
　　 方法:
　　 1、剖腹產(chǎn)手術(shù)獲得腹部皮下脂肪，0.15％Ⅰ型膠原酶消化法獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞行體外培養(yǎng)。用MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)繪制增殖曲線，用流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期，用流式細(xì)

2、胞及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原，用成骨成脂分化鑒定其多向分化潛能。
　　 2、通過將SCF、EDN3、bFGF等添加到條件培養(yǎng)基中，體外誘導(dǎo)第5代hADSCs向黑素細(xì)胞分化，誘導(dǎo)至第10周。使用qRT-PCR檢測黑素相關(guān)基因MITF，KIT，DCT，TYR，TYRP1，SOX10mRNA的表達(dá)水平。誘導(dǎo)結(jié)束后，通過多巴染色、免疫細(xì)胞化學(xué)法、細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1、hADSCs的分離

3、、培養(yǎng)和鑒定:
　　 (1)通過分離培養(yǎng)，獲得了大量旋渦狀生長的成纖維樣hADSCs。
　　 (2)MTT法顯示細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
　　 (3)細(xì)胞周期檢測顯示:第3代hADSCs90.76％處于G0～G1期，9.24％的細(xì)胞處于S+G2期;第10代hADSCs仍有88.63％處于G0～G1期，11.37％的細(xì)胞處于S+G2期。表明體外培養(yǎng)的hADSCs具有穩(wěn)定的增殖能力。
　　 (4)流式鑒定結(jié)果示:CD

4、29+、CD31-、CD34-、CD45-、CD73+、CD105+、CD166+、HLA-DR-。
　　 (5)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與流式細(xì)胞檢測高表達(dá)的結(jié)果一致。
　　 (6)hADSCs在特定誘導(dǎo)條件下，具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。qRT-PCR結(jié)果顯示:成骨成脂相關(guān)基因OPN及PPARγ-2各有時間依賴遞增表達(dá)，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 (7)在成骨分化過程中，發(fā)現(xiàn)同時伴有成脂發(fā)生。與對照

5、組相比，成骨誘導(dǎo)組PPARγ-2mRNA有時間依賴性遞增表達(dá)，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 2、體外誘導(dǎo)hADSCs向黑素細(xì)胞分化:
　　 (1)分化過程中，光鏡下細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)殡p極化、多極化為主的類黑素細(xì)胞樹突狀結(jié)構(gòu)。
　　 (2)在10周的誘導(dǎo)過程中，qRT-PCR結(jié)果顯示，黑素相關(guān)基因MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10mRNA的表達(dá)升高，與正常對照組比較，t值分別為

6、16.34、22.93、13.03、25.63、14.02、9.24(P＜0.01)。
　　 (3)誘導(dǎo)結(jié)束后，多巴染色誘導(dǎo)組呈陽性，對照組陰性。
　　 (4)誘導(dǎo)結(jié)束后，免疫細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)組MITF、HMB45染色均陽性，正常對照組分別為弱陽性和陰性。
　　 (5)細(xì)胞免疫熒光TYRP1，S100誘導(dǎo)組陽性表達(dá)，對照組陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、建立了一個高效分離培養(yǎng)hADSCs的方法，所