酸敏感離子通道在心肌上的表達(dá)和分布及其電生理特性.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：ASICs mRNA和蛋白在心肌組織和心肌細(xì)胞上的表達(dá)
　　 目的：探討心肌組織和心肌細(xì)胞上是否有ASICs的表達(dá)。
　　 方法：應(yīng)用SD大鼠的心肌組織和心室肌細(xì)胞，采用RT-PCR，Western bloting,和免疫熒光的方法，觀察酸敏感離子通道在心肌組織和心室肌細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)和分布情況。
　　 結(jié)果：ASICs mRNA和蛋白在心臟組織和心室肌細(xì)胞上有表達(dá)

2、。
　　 1. RT-PCR結(jié)果表明在心臟組織中存在ASIC1，ASIC2a和ASIC3的mRNA的表達(dá)。其基因片段堿基數(shù)分別為140bp，139bp,和107bp。
　　 2. Western Blotting結(jié)果提示在心臟組織和培養(yǎng)心室肌細(xì)胞上均有ASIC1，ASIC2a和ASIC3蛋白的表達(dá)。其中，心肌組織中的ASICs總量明顯多于心肌細(xì)胞；與神經(jīng)組織上的ASICs一致，三種ASICs蛋白印跡的具體位置是均在55～

3、72kDa之間，其中ASIC1的分子量稍大，ASIC2a和ASIC3相似。
　　 3.免疫熒光標(biāo)記在心臟組織和培養(yǎng)心室肌細(xì)胞上均有ASIC1，ASIC2a和ASIC3蛋白的表達(dá)。從熒光密度上看，三種亞單位的表達(dá)強(qiáng)度并無明顯區(qū)別，但其分布并不完全一致。ASIC1大部分分布于心肌細(xì)胞核內(nèi)，僅少量分布于胞漿和胞膜上；ASIC2a大部分分布于胞核，但也有相當(dāng)?shù)臄?shù)量分布于胞漿和胞膜；ASIC3則正好相反，大部分分布于胞膜和胞漿，少量分布于

4、胞核。不同亞單位 (ASIC1，ASIC2a以及ASIC3)在胞漿和胞膜的熒光密度分別為：32.01±5.98 (n=8)；21.83±4.83 (n=10)和12.43±3.46 (n=11)。
　　 結(jié)論：
　　 1. RT-PCR結(jié)果表明在心臟組織中存在ASIC1，ASIC2a和ASIC3的mRNA的表達(dá)。
　　 2.免疫熒光和Western Blotting證明在心臟組織和培養(yǎng)心室肌細(xì)胞上均有ASIC1，

5、ASIC2a和ASIC3蛋白的表達(dá)，并且三者分布各有特點(diǎn)。
　　 第二部分：原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞上酸誘發(fā)的電流
　　 目的：研究心肌細(xì)胞上ASICs通道的功能和電生理學(xué)特性。
　　 方法：在原代培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞上采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄酸引發(fā)的電流。
　　 結(jié)果：在所有細(xì)胞中，對酸有反應(yīng)的細(xì)胞比例是75.34%，其中ASICs樣電流所占比例是43.83%，TRPV1樣電流所占比例是34.25%，部分細(xì)胞兩種電

6、流都存在。
　　 1. 在大鼠心室肌細(xì)胞上存在酸引發(fā)的ASICs樣電流(1)ASICs樣電流可以被阿米洛利 (100 μM)可逆性阻斷，并且發(fā)現(xiàn)幾乎所有類型的ASICs樣電流均存在于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上，包括ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a和ASIC3，也不排除各種亞基以異聚體通道的形式出現(xiàn)。
　　 (2)當(dāng)pH7.0時(shí)，便可以引發(fā)出ASICs樣電流。所引發(fā)的ASICs樣電流具有PH值依賴性，電流密度-pH曲線呈倒“

7、S”型，pH從6.0到5.0之間有一個(gè)較大的跳躍。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：pH7.0時(shí)，ASICs電流密度為8.51±4.37 pA/pF (n=8)；pH6.0時(shí)，ASICs電流密度為17.03±5.02 pA/pF (n=11)；pH5.0時(shí)，ASICs電流密度為50.20±6.94 pA/pF (n=7)；pH4.0時(shí)，ASICs電流密度為53.73±9.87 pA/pF(n=7)。經(jīng)Hill方程擬合，其pH50為5.73±0.18。該pH

8、50值與ASIC1b(約為5.9)相近。
　　 2. 在大鼠心室肌細(xì)胞上存在酸引發(fā)的TRPV1樣電流TRPV1樣電流可以被20 μM的CPZ可逆性阻斷，并且具有pH值依賴性。在 pH6.0的條件下，培養(yǎng)心室肌細(xì)胞上TRPV1的電流密度是9.52±4.89pA/pF (n=5)。
　　 結(jié)論：
　　 1. 大鼠原代培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞上存在兩種酸引發(fā)的電流。
　　 一種是瞬時(shí)的，可以被阿米洛利可逆性阻斷，可能為

9、ASICs樣電流；另外一種是持續(xù)性的，可以被CPZ可逆性阻斷，可能為TRPV1樣電流。
　　 2. 在原代培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞上記錄到的ASICs樣電流，經(jīng)Hill方程擬合，其pH50大約是5.73。與ASIC1b的pH50 5.9最接近，所以推斷電流成分中ASIC1b可能占優(yōu)勢，但是其它電流也是存在的，其中可能有相當(dāng)量的ASIC2a，ASIC3。
　　 第三部分：急性分離心肌細(xì)胞上酸引發(fā)的電流
　　 目的：為了進(jìn)一

10、步研究急性分離心室肌細(xì)胞上ASICs通道的電生理特點(diǎn)，并與培養(yǎng)心肌細(xì)胞比較。
　　 方法：在急性分離的大鼠心室肌細(xì)胞上采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄酸引發(fā)的電流。
　　 結(jié)果：所有細(xì)胞中，對酸的反應(yīng)率是84.62%，ASICs樣電流所占比例是61.54%，TRPV1樣電流所占比例是23.08%，其中有部分細(xì)胞同時(shí)存在兩種電流。
　　 1. 在大鼠急性分離的心室肌細(xì)胞上存在酸引發(fā)的ASICs樣電流，并記錄到三種ASICs

11、樣電流。ASICs樣電流可以被100 μM的阿米洛利可逆性阻斷，pH6.0時(shí)ASICs的電流密度為9.22±5.19 pA/pF (n=5)。
　　 2. 在大鼠急性分離的心室肌細(xì)胞上存在酸引發(fā)的TRPV1樣電流。TRPV1樣電流可以被20μM的CPZ可逆性阻斷，pH6.0時(shí)，TRPV1的電流密度是1.69±0.26 pA/pF (n=3)。
　　 結(jié)論：成年大鼠急性分離心室肌細(xì)胞上存在兩種酸引發(fā)的電流，一種是瞬時(shí)的，可