稻飛虱捕食性天敵黑肩綠盲蝽煙堿型乙酰膽堿受體毒理學(xué)特性研究.pdf

1、黑肩綠盲蝽(Cyrtorhinus lividipennis)作為稻飛虱重要捕食性天敵，主要捕食稻飛虱卵和低齡若蟲(chóng)，在褐飛虱種群自然控制中發(fā)揮著不可忽略的作用。然而，殺蟲(chóng)劑的不合理使用不僅使褐飛虱等靶標(biāo)生物對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性，某些殺蟲(chóng)劑還對(duì)黑肩綠盲蝽等天敵具有較強(qiáng)的殺傷力。有研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲(chóng)啉等新煙堿類殺蟲(chóng)劑在黑肩綠盲蝽和褐飛虱間不具備選擇性，且亞致死劑量處理下也會(huì)顯著影響黑肩綠盲蝽卵孵化率、捕食量、產(chǎn)卵量。然而對(duì)于黑肩綠盲蝽體內(nèi)新煙堿

2、類殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)——煙堿型乙酰膽堿受體的相關(guān)研究至今仍是空白。強(qiáng)調(diào)綜合防治的植保方針要求我們充分利用和保護(hù)天敵。這促使我們通過(guò)研究黑肩綠盲蝽煙堿型乙酰膽堿受體的毒理學(xué)特性，進(jìn)一步探索其對(duì)新煙堿類殺蟲(chóng)劑高敏感性的分子機(jī)制，以應(yīng)用于高效高選擇性的新殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)。
　　本文結(jié)合室內(nèi)條件下新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)黑肩綠盲蝽及褐飛虱選擇性評(píng)估的結(jié)果，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)及分子生物學(xué)方法對(duì)黑肩綠盲蝽煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)亞基進(jìn)行了克隆，并

3、對(duì)其中與褐飛虱表現(xiàn)出重要氨基酸差異的α8亞基進(jìn)行了毒理學(xué)特性研究，通過(guò)探索黑肩綠盲蝽對(duì)新煙堿類殺蟲(chóng)劑高敏感性的原因，來(lái)進(jìn)一步研究新煙堿類殺蟲(chóng)劑選擇作用的分子機(jī)制。
　　通過(guò)藥膜法，測(cè)定了4種新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)田間品系黑肩綠盲蝽及褐飛虱的毒力。通過(guò)比較同一藥劑對(duì)兩種昆蟲(chóng)的LC50，得到相應(yīng)藥劑的選擇性指數(shù)，并據(jù)此評(píng)估藥劑在害蟲(chóng)和天敵間的選擇性。此外測(cè)定了吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)胺這兩種殺蟲(chóng)劑對(duì)室內(nèi)敏感品系黑肩綠盲蝽及褐飛虱的毒力并評(píng)估殺蟲(chóng)劑選擇性

4、。綜合分析田間種群與室內(nèi)敏感品系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)新煙堿類殺蟲(chóng)劑在天敵和害蟲(chóng)間的選擇性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示:吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)胺和噻蟲(chóng)啉對(duì)黑肩綠盲蝽三齡若蟲(chóng)的LC50均遠(yuǎn)小于這兩種藥劑對(duì)褐飛虱三齡若蟲(chóng)的LC50，這三種殺蟲(chóng)劑對(duì)黑肩綠盲蝽三齡若蟲(chóng)的毒殺作用均明顯大于對(duì)褐飛虱的毒殺作用，不具有利于生物防治的選擇性;而呋蟲(chóng)胺對(duì)兩者的毒力作用差異較小。通過(guò)整理轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼接結(jié)果，并采用特異引物RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了黑肩綠盲蝽9個(gè)煙堿型乙酰膽堿受體

5、亞基基因。其中包括4個(gè)全長(zhǎng)基因和5個(gè)5'-/3'-端不全的長(zhǎng)片段。通過(guò)與其他昆蟲(chóng)nAChRs亞基序列比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)亞基具有煙堿型乙酰膽堿α亞基的典型特征，3個(gè)具有β亞基的典型結(jié)構(gòu)，此外，9個(gè)亞基結(jié)構(gòu)特征分析也顯示，它們均具有煙堿型乙酰膽堿受體亞基的典型特征，例如保守的半胱氨酸、胞外區(qū)與配基結(jié)合密切相關(guān)的環(huán)[loopA-C(α亞基)，loopD-F(β亞基)]、4個(gè)跨膜片段及糖基化位點(diǎn)等。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，分別將這9個(gè)亞基命名為

6、Clα1、Clα2、Clα3、Clα4、Clα7、Clα8、Clβ1、Clβ2和Clβ3。
　　通過(guò)序列比較，發(fā)現(xiàn)黑肩綠盲蝽與褐飛虱的α8存在重要氨基酸位點(diǎn)差異。將Clα8與褐飛虱Nlα8存在氨基酸差異的重要位點(diǎn)引入單突變或雙突變，與大鼠β2亞基構(gòu)建雜合受體Clα8/rβ2，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中成功表達(dá)。對(duì)比野生型重組受體Clα8/rβ2、突變型重組受體Clα8/rβ2及褐飛虱Nlα8/rβ2的激動(dòng)劑反應(yīng)，以研究黑肩綠盲蝽野生型C

7、lα8亞基的Loop B和Loop C上一些關(guān)鍵氨基酸變化對(duì)其毒理學(xué)特性的影響。結(jié)果顯示，B環(huán)上單個(gè)氨基酸突變N191F能顯著降低Clα8/rβ2對(duì)吡蟲(chóng)啉敏感性。C環(huán)上的單個(gè)氨基酸改變E240T本身并不直接影響吡蟲(chóng)啉敏感性的影響，但當(dāng)兩個(gè)突變(N191F和E240T)同時(shí)存在時(shí)，受體的敏感性比引入單突變N191F時(shí)降低更顯著。結(jié)果表明，B環(huán)上191位的氨基酸N在Clα8/β2對(duì)吡蟲(chóng)啉的敏感性中具有決定性的作用，而C環(huán)上240位的氨基酸E