稻飛虱捕食性天敵黑肩綠盲蝽煙堿型乙酰膽堿受體毒理學(xué)特性研究.pdf

1、黑肩綠盲蝽(Cyrtorhinus lividipennis)作為稻飛虱重要捕食性天敵，主要捕食稻飛虱卵和低齡若蟲，在褐飛虱種群自然控制中發(fā)揮著不可忽略的作用。然而，殺蟲劑的不合理使用不僅使褐飛虱等靶標(biāo)生物對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性，某些殺蟲劑還對黑肩綠盲蝽等天敵具有較強(qiáng)的殺傷力。有研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑在黑肩綠盲蝽和褐飛虱間不具備選擇性，且亞致死劑量處理下也會(huì)顯著影響黑肩綠盲蝽卵孵化率、捕食量、產(chǎn)卵量。然而對于黑肩綠盲蝽體內(nèi)新煙堿

2、類殺蟲劑的作用靶標(biāo)——煙堿型乙酰膽堿受體的相關(guān)研究至今仍是空白。強(qiáng)調(diào)綜合防治的植保方針要求我們充分利用和保護(hù)天敵。這促使我們通過研究黑肩綠盲蝽煙堿型乙酰膽堿受體的毒理學(xué)特性，進(jìn)一步探索其對新煙堿類殺蟲劑高敏感性的分子機(jī)制，以應(yīng)用于高效高選擇性的新殺蟲劑的開發(fā)。
　　本文結(jié)合室內(nèi)條件下新煙堿類殺蟲劑對黑肩綠盲蝽及褐飛虱選擇性評估的結(jié)果，通過高通量測序技術(shù)及分子生物學(xué)方法對黑肩綠盲蝽煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)亞基進(jìn)行了克隆，并

3、對其中與褐飛虱表現(xiàn)出重要氨基酸差異的α8亞基進(jìn)行了毒理學(xué)特性研究，通過探索黑肩綠盲蝽對新煙堿類殺蟲劑高敏感性的原因，來進(jìn)一步研究新煙堿類殺蟲劑選擇作用的分子機(jī)制。
　　通過藥膜法，測定了4種新煙堿類殺蟲劑對田間品系黑肩綠盲蝽及褐飛虱的毒力。通過比較同一藥劑對兩種昆蟲的LC50，得到相應(yīng)藥劑的選擇性指數(shù)，并據(jù)此評估藥劑在害蟲和天敵間的選擇性。此外測定了吡蟲啉和噻蟲胺這兩種殺蟲劑對室內(nèi)敏感品系黑肩綠盲蝽及褐飛虱的毒力并評估殺蟲劑選擇性

4、。綜合分析田間種群與室內(nèi)敏感品系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對新煙堿類殺蟲劑在天敵和害蟲間的選擇性進(jìn)行評估。結(jié)果顯示:吡蟲啉、噻蟲胺和噻蟲啉對黑肩綠盲蝽三齡若蟲的LC50均遠(yuǎn)小于這兩種藥劑對褐飛虱三齡若蟲的LC50，這三種殺蟲劑對黑肩綠盲蝽三齡若蟲的毒殺作用均明顯大于對褐飛虱的毒殺作用，不具有利于生物防治的選擇性;而呋蟲胺對兩者的毒力作用差異較小。通過整理轉(zhuǎn)錄組測序拼接結(jié)果，并采用特異引物RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了黑肩綠盲蝽9個(gè)煙堿型乙酰膽堿受體

5、亞基基因。其中包括4個(gè)全長基因和5個(gè)5'-/3'-端不全的長片段。通過與其他昆蟲nAChRs亞基序列比對和分析，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)亞基具有煙堿型乙酰膽堿α亞基的典型特征，3個(gè)具有β亞基的典型結(jié)構(gòu)，此外，9個(gè)亞基結(jié)構(gòu)特征分析也顯示，它們均具有煙堿型乙酰膽堿受體亞基的典型特征，例如保守的半胱氨酸、胞外區(qū)與配基結(jié)合密切相關(guān)的環(huán)[loopA-C(α亞基)，loopD-F(β亞基)]、4個(gè)跨膜片段及糖基化位點(diǎn)等。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，分別將這9個(gè)亞基命名為

6、Clα1、Clα2、Clα3、Clα4、Clα7、Clα8、Clβ1、Clβ2和Clβ3。
　　通過序列比較，發(fā)現(xiàn)黑肩綠盲蝽與褐飛虱的α8存在重要氨基酸位點(diǎn)差異。將Clα8與褐飛虱Nlα8存在氨基酸差異的重要位點(diǎn)引入單突變或雙突變，與大鼠β2亞基構(gòu)建雜合受體Clα8/rβ2，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中成功表達(dá)。對比野生型重組受體Clα8/rβ2、突變型重組受體Clα8/rβ2及褐飛虱Nlα8/rβ2的激動(dòng)劑反應(yīng)，以研究黑肩綠盲蝽野生型C

7、lα8亞基的Loop B和Loop C上一些關(guān)鍵氨基酸變化對其毒理學(xué)特性的影響。結(jié)果顯示，B環(huán)上單個(gè)氨基酸突變N191F能顯著降低Clα8/rβ2對吡蟲啉敏感性。C環(huán)上的單個(gè)氨基酸改變E240T本身并不直接影響吡蟲啉敏感性的影響，但當(dāng)兩個(gè)突變(N191F和E240T)同時(shí)存在時(shí)，受體的敏感性比引入單突變N191F時(shí)降低更顯著。結(jié)果表明，B環(huán)上191位的氨基酸N在Clα8/β2對吡蟲啉的敏感性中具有決定性的作用，而C環(huán)上240位的氨基酸E