昆蟲乙酰膽堿受體β亞基毒理學(xué)特性研究與新外源表達(dá)平臺(tái)的建立.pdf

1、基因的外源表達(dá)是研究基因功能的一種重要方法。通過普通分子生物學(xué)技術(shù)和基因組測序技術(shù)，目前已經(jīng)從很多種昆蟲中鑒定了煙堿型乙酰膽堿受體亞基的基因，但是在外源表達(dá)時(shí)并不能表達(dá)出有功能的受體。
　　 本文用分子生物學(xué)方法和電生理學(xué)方法，對(duì)昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)β亞基進(jìn)行了克隆，并對(duì)幾種昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)β亞基重要功能環(huán)和環(huán)上氨基酸變化進(jìn)行了毒理學(xué)特性分析，以期探明幾種昆蟲nAChRsβ亞基的結(jié)構(gòu)與

2、功能，進(jìn)一步探索新煙堿類殺蟲劑選擇作用的分子機(jī)制。由于昆蟲單亞基表達(dá)或少數(shù)幾個(gè)亞基共表達(dá)均不能在外源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出功能受體(一般認(rèn)為是β亞基的問題)，說明需要更多的煙堿型乙酰膽堿受體亞基共表達(dá)，或者需要與一些附屬蛋白共表達(dá)，這樣就要求在外源表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染或者注射更多的受體mRNA，需要提高外源細(xì)胞的接受量。根據(jù)非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)外源受體的特點(diǎn)，考慮到中華大蟾蜍卵母細(xì)胞的體積優(yōu)勢，本文在開發(fā)中華大蟾蜍卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)方面開展了一些探索

3、。成功組建了電生理實(shí)驗(yàn)室，掌握了中華大蟾蜍的室內(nèi)飼養(yǎng)方法、室內(nèi)飼養(yǎng)對(duì)中華大蟾蜍生殖的影響因素和人工條件下獲得中華大蟾蜍成熟卵母細(xì)胞的方法，最后對(duì)中華大蟾蜍成熟卵母細(xì)胞內(nèi)源受體進(jìn)行了分析，對(duì)可表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行研究，取得了部分有價(jià)值的進(jìn)展和成果。
　　 一、昆蟲nAChRsβ亞基D、E、F環(huán)上氨基酸對(duì)新煙堿類殺蟲劑選擇性影響本文對(duì)模式昆蟲果蠅和農(nóng)業(yè)昆蟲桃蚜的nAChRsβ1亞基D、E、F環(huán)及環(huán)上氨基酸變化對(duì)乙酰膽堿和吡蟲啉的影響進(jìn)

4、行了雙電極電壓鉗檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，把模式昆蟲果蠅和農(nóng)業(yè)昆蟲桃蚜的nAChRsβ1亞基D、E、F環(huán)單獨(dú)或整體引入到大鼠的β2亞基中與褐飛虱α1亞基共表達(dá)，與野生型(褐飛虱α1亞基和大鼠的β2亞基，N1α1-β2)相比，電生理檢測發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的嵌合體對(duì)新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉的敏感性上升，而對(duì)乙酰膽堿的影響基本上沒有變化。同時(shí)把發(fā)生在loopE S131 Y(R)、D133N和loopFT191W、P192K氨基酸變化引入到大鼠β2亞基中與褐飛虱

5、α1亞基共表達(dá)，與野生型N1α1-β2相比，電生理檢測發(fā)現(xiàn)對(duì)新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉的敏感性上升，而對(duì)乙酰膽堿的影響基本上沒有變化。電生理記錄結(jié)果顯示昆蟲nAChRsβ亞基D、E、F環(huán)上氨基酸對(duì)新煙堿類殺蟲劑選擇性有重要的影響。
　　 二、褐飛虱nAChRsβ1亞基的克隆和A-to-I RNA編輯位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)采用簡并引物PCR和RACE技術(shù)首次從水稻害蟲褐飛虱中克隆了具有典型結(jié)構(gòu)煙堿型乙酰膽堿受體β亞基，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)此基因具有煙堿型

6、乙酰膽堿受體亞基的典型特征，如位于胞外區(qū)氨基端與配基結(jié)合密切相關(guān)的保守氨基酸殘基形成的環(huán)loopD-F、由13個(gè)氨基酸殘基隔開的含有兩個(gè)二硫鍵的半胱氨酸環(huán)、4個(gè)保守的跨膜片段、以及TM3和TM4之間可變的胞內(nèi)區(qū)等。因此，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將這個(gè)基因命名為N1β1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在這個(gè)β亞基的氨基端有6個(gè)A-to-I RNA編輯位點(diǎn)，其中四個(gè)引起了氨基酸變化，位點(diǎn)2和位點(diǎn)5分別位于loopD和loopE上，引起了氨基酸天冬酰胺(N)到天冬氨酸(

7、D)變化。在不同的褐飛虱品系中發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)2在敏感品系中發(fā)生頻率較高，而位點(diǎn)5在抗性品系中發(fā)生頻率較高，其他幾個(gè)位點(diǎn)在兩種褐飛虱品系中發(fā)生頻率是沒有變化的。
　　 三、A-to-I RNA編輯在褐飛虱中對(duì)新煙堿類殺蟲劑敏感性的作用把在褐飛虱煙堿型乙酰膽堿受體β1亞基loopD和loopE上發(fā)現(xiàn)的RNA編輯引起的氨基酸天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)變化引入到大鼠的β2亞基中，構(gòu)建成突變體β2N73D、β2loopD-N73D以及β2

8、N133D、β2loopE-N133D與褐飛虱α1亞基共表達(dá)，與野生型即褐飛虱α1亞基和大鼠的β2亞基(N1α1-β2和N1α1-β2loopD)相比，電生理檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在D環(huán)上的RNA編輯引起的N73D變化，降低了激動(dòng)劑乙酰膽堿(ACh)和吡蟲啉(IMI)的敏感性，但是對(duì)乙酰膽堿的影響大于吡蟲啉;而發(fā)生在E環(huán)上的RNA編輯引起的N133D變化僅對(duì)吡蟲啉的敏感性有影響，對(duì)乙酰膽堿的影響是沒有變化的。由此認(rèn)為，發(fā)生在褐飛虱煙堿型乙酰膽堿

9、受體β1亞基loopD和loopE上RNA編輯引起的氨基酸天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)變化，對(duì)新煙堿類殺蟲劑的敏感性是有關(guān)的，但是不同環(huán)上氨基酸的變化起的作用不同。
　　 四、中華大蟾蜍生物學(xué)特性研究本文研究了中華大蟾蜍的室內(nèi)飼養(yǎng)方法、室內(nèi)飼養(yǎng)對(duì)中華大蟾蜍卵母細(xì)胞成熟的影響因素和人工條件下獲得成熟卵母細(xì)胞的方法。研究發(fā)現(xiàn)，中華大蟾蜍在環(huán)境溫度＜15℃時(shí)，處于冬眠期，這時(shí)室內(nèi)飼養(yǎng)只要保持足夠的濕度和通風(fēng)即可，而環(huán)境溫度＞15℃時(shí)

10、，中華大蟾蜍開始取食，每周在清晨或黃昏喂食2％3次活體黃粉蟲，每周換水3～4次，保證中華大蟾蜍的排泄物及時(shí)清除，室內(nèi)飼養(yǎng)的適宜溫度是18～22℃。長期生長在高溫或昏暗環(huán)境下的中華大蟾蜍是不能產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞的。中華大蟾蜍必須經(jīng)過足夠時(shí)間的低溫處理，體內(nèi)一種被稱為“冬眠因子”的生長調(diào)控因子才能發(fā)揮作用，從而引發(fā)生發(fā)泡的破裂，使中華大蟾蜍卵母細(xì)胞成熟。4～6℃環(huán)境中處理一周至一個(gè)月時(shí)間的中華大蟾蜍，注射4000IU/千克絨毛膜促性腺激素(C

11、G)或8個(gè)/千克腦垂體(PG)，經(jīng)過3～5天，可產(chǎn)生成熟的卵母細(xì)胞。
　　 五、中華大蟾蜍卵母細(xì)胞內(nèi)源性離子通道的表達(dá)分析對(duì)中華大蟾蜍卵母細(xì)胞內(nèi)源性基因表達(dá)進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)用雙電極電壓鉗技術(shù)在具有濾泡膜和無濾泡膜的中華大蟾蜍卵母細(xì)胞上記錄由乙酰膽堿(ACh)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)激活的配基門控離子受體超家族受體引起的電流，并與非洲爪蟾卵母細(xì)胞和先前在中華大蟾蜍卵母細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，在具有濾泡

12、膜的中華大蟾蜍卵母細(xì)胞上，乙酰膽堿、γ-氨基丁酸、甘氨酸受體均有不同程度的表達(dá)，表達(dá)對(duì)1mM乙酰膽堿、γ-氨基丁酸、甘氨酸引起的電流值分別是87.1±4.9nA、45.4±13.8nA、36.6±22.0nA;而無濾泡膜的中華大蟾蜍卵母細(xì)胞上，對(duì)乙酰膽堿、γ-氨基丁酸、甘氨酸的刺激檢測不到任何電流信號(hào)。本工作的一個(gè)目的是探討兩種蟾蜍卵母細(xì)胞內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道的表達(dá)，探索中華大蟾蜍卵母細(xì)胞作為外源表達(dá)工具的可能性。
　　

13、 六、中華大蟾蜍卵母細(xì)胞表達(dá)外源通道的研究本章主要是對(duì)中華大蟾蜍卵母細(xì)胞的外源表達(dá)進(jìn)行了研究。分別將美洲大蠊神經(jīng)索和秀麗隱桿線蟲的mRNA注射到中華大蟾蜍的卵母細(xì)胞中，利用雙電極電壓鉗檢測發(fā)現(xiàn)，在去除濾泡膜的中華大蟾蜍卵母細(xì)胞上記錄到由乙酰膽堿(ACh)、γ-氨基丁酸(GABA)刺激引起的電流信號(hào)。在注射美洲大蠊神經(jīng)索mRNA的卵母細(xì)胞上，1mM/L乙酰膽堿、γ-氨基丁酸引起的電流值分別是98.1±4.9nA、329.5±6.3nA;在

14、注射秀麗隱桿線蟲的mRNA的卵母細(xì)胞上，1mM/L乙酰膽堿、γ-氨基丁酸引起的電流值分別是84.1±13.8nA、89.5±7.9nA。作為隱性對(duì)照，在未注射mRNA的去除濾泡膜的卵母細(xì)胞上，沒有檢測到任何由乙酰膽堿、γ-氨基丁酸刺激引起的電流信號(hào)。結(jié)果顯示，注射了外源mRNA的去除濾泡膜的中華大蟾蜍卵母細(xì)胞上，乙酰膽堿受體和γ-氨基丁酸受體均有表達(dá)。本工作的一個(gè)目的是探討中華大蟾蜍卵母細(xì)胞作為外源性神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道表達(dá)系統(tǒng)的可行