WT1基因在急性白血病的表達及其治療意義的研究.pdf

1、山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文WT1基因在急性白血病的表達及其治療意義的研究姓名：白波申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：王宏偉20060518山西醫(yī)抖大學(xué)博士學(xué)位論文第二部分siR從對HE垃93細胞耵1基因表達的抑制摘要目的設(shè)計、化學(xué)合成三對特異性針對人類wTl基因的siRNA，研究對HEK293細胞WTl基因和蛋白表達的抑止作用，篩選出抑制作用最顯著的一對WTlsiRNA，用于后續(xù)實驗中對白血病細胞生物學(xué)特性影響的研究。方法1根據(jù)NC

2、BI基因庫檢索到人類wTl基因的cDNA序列全長，設(shè)計、合成特異性siRNA。2用Liperfectamine2000轉(zhuǎn)染100nmol／L熒光標(biāo)記的陰性對照siRNA(5一FAM標(biāo)記)進入HEK293細胞，培養(yǎng)24h，用熒光顯微鏡計數(shù)熒光標(biāo)記細胞的數(shù)目，計算轉(zhuǎn)染的百分率。3100nmol／LGAPDHsiRNA(陽性對照)用Liperfectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)48、72h后，用Westernblot方法檢測H

3、EK293細胞GAPDH蛋白的表達，進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率及試驗條件。4100nmoVLWTlsiRNA(si—wtl一1、siwtl2、siwtl3)和陰性對照分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)24h、48h和72h，用熒光定量RTPCR方法檢測HEK293細胞wTl基因的表達(13actin作為內(nèi)參照)。5100nmol／LWTlsiRNA(siwtl1、siwtl2、siwtl3)和陰性對照分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)48h、72h和9

4、6h，用Westemblot方法檢測HEK293細胞wTl蛋白的表達(GAPDH作為內(nèi)參照)。660、80、100、120nmol／LWTlsiRNA(siwtI1)分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)48h，用熒光定量RTPCR方法檢測HEK293細胞wTl基因的表達。結(jié)果1Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染100nmol／L熒光標(biāo)記陰性對照siRNA進入HEK293細胞，轉(zhuǎn)染效率達80％以上。2100nmol／L各組siRNA轉(zhuǎn)染HE

5、K293細胞，培養(yǎng)24h和48h，siwtl1組wTl基因表達與空白對照、陰性對照、siwtl一2和siwtl3組有顯著性差異(PO05)。3100nmol／Lsiwtl1轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)24h、48h和72h。其中，24h組和48h組WTl基因表達水平明顯低于72小時組(PO05)。4100nmol／L各組siRNA轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)48h、72h和96h。其中，si—wtl1組WTl蛋白表達水平與空白對照、陰性對照