DcR3和EGFR基因共沉默抑制對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480體外生長(zhǎng)影響的研究.pdf

1、目的：DcR3誘騙受體3(decoy receptor3，DcR3)是Pitti RM等在1998年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factorreceptor），TNFR超家族成員，并命名為DcR3誘騙受體3(decoy receptor3，DcR3。DcR3缺乏跨膜序列，是一種分泌蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化以及抗凋亡的生物學(xué)特性，具有廣闊應(yīng)用前景。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth

2、 factor receptor,EGFR)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞的增殖、分化、生存、轉(zhuǎn)移等的調(diào)節(jié)息息相關(guān)，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)，其靶向藥物西妥昔單抗已經(jīng)應(yīng)用于臨床且取得良好的效果。RNA干擾是一種基因表達(dá)抑制的方法，由序列特異性的雙鏈RNA（小片斷RNA大約21-23bp即siRNA）所誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，具有高度特異性和高效持久性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)DcR3、EGFR的cDNA序列構(gòu)建分別針對(duì)DcR3和EGFR的siRNA，探討通過(guò)siRNA

3、共沉默DcR3和EGFR對(duì)SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況的影響的研究，并與沉默單個(gè)基因的作用效果進(jìn)行比較。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)根據(jù)DcR3、EGFR的cDNA序列分別設(shè)計(jì)和合成3對(duì)針對(duì)DcR3和EGFR的siRNA，分別通過(guò)脂質(zhì)體將各個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染入SW480細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)定量Realtime-PCR檢測(cè)各個(gè)siRNA對(duì)其靶基因mRNA下調(diào)作用，通過(guò)Western blo t檢測(cè)其靶基因蛋白的表達(dá)，分別篩選出針對(duì)Dc R3和EGF R

4、抑制效果最強(qiáng)的siRNA，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對(duì)DcR3和EGFR作用效果最強(qiáng)的siRNA單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞；通過(guò)MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)，比較各處理組細(xì)胞的增殖活性和凋亡狀態(tài)。
　　結(jié)果：①realtime-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3對(duì)針對(duì)DcR3的siRNA對(duì)SW480細(xì)胞的靶基因的mRNA抑制效率為32％，42%，30%，3對(duì)針對(duì)EGFR的siRNA對(duì)SW480細(xì)胞的靶基因的mRNA抑制效率

5、39%，63%，48%；通過(guò)western blot檢查證實(shí)，這些siRNA對(duì)SW480細(xì)胞靶基因蛋白的表達(dá)抑制效果與realtime-PCR所檢查結(jié)果基本一致；②單基因沉默組和雙基因共沉默組均較對(duì)照組具有明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用（P<0.05）；③雙基因共沉默組較單基因沉默組具有明顯抑制SW480細(xì)胞增殖的作用(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后雙基因共沉默組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率為（20.1±1.7）%，高于單基

6、因沉默組Dc R3基因沉默凋亡率（16.5±2.2）%和EGFR基因沉默凋亡率（15.9±1.3）%(P<0.05)。
　　結(jié)論：①DcR3siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后可有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的DcR3mRNA和蛋白的表達(dá)，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染SW480后可有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)。②轉(zhuǎn)染DcR3siRNA和/或轉(zhuǎn)染EGFR s iRNA的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480均表現(xiàn)出明顯的