DcR3和EGFR基因共沉默抑制對人結(jié)腸癌細胞株SW480體外生長影響的研究.pdf

1、目的：DcR3誘騙受體3(decoy receptor3，DcR3)是Pitti RM等在1998年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factorreceptor），TNFR超家族成員，并命名為DcR3誘騙受體3(decoy receptor3，DcR3。DcR3缺乏跨膜序列，是一種分泌蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育和分化以及抗凋亡的生物學(xué)特性，具有廣闊應(yīng)用前景。表皮生長因子受體(epidermal growth

2、 factor receptor,EGFR)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細胞的增殖、分化、生存、轉(zhuǎn)移等的調(diào)節(jié)息息相關(guān)，是腫瘤治療的重要靶點，其靶向藥物西妥昔單抗已經(jīng)應(yīng)用于臨床且取得良好的效果。RNA干擾是一種基因表達抑制的方法，由序列特異性的雙鏈RNA（小片斷RNA大約21-23bp即siRNA）所誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，具有高度特異性和高效持久性。本實驗根據(jù)DcR3、EGFR的cDNA序列構(gòu)建分別針對DcR3和EGFR的siRNA，探討通過siRNA

3、共沉默DcR3和EGFR對SW480細胞體外生長情況的影響的研究，并與沉默單個基因的作用效果進行比較。
　　方法：本實驗根據(jù)DcR3、EGFR的cDNA序列分別設(shè)計和合成3對針對DcR3和EGFR的siRNA，分別通過脂質(zhì)體將各個siRNA轉(zhuǎn)染入SW480細胞，通過實時定量Realtime-PCR檢測各個siRNA對其靶基因mRNA下調(diào)作用，通過Western blo t檢測其靶基因蛋白的表達，分別篩選出針對Dc R3和EGF R

4、抑制效果最強的siRNA，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對DcR3和EGFR作用效果最強的siRNA單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW480細胞；通過MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡狀態(tài)，比較各處理組細胞的增殖活性和凋亡狀態(tài)。
　　結(jié)果：①realtime-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，3對針對DcR3的siRNA對SW480細胞的靶基因的mRNA抑制效率為32％，42%，30%，3對針對EGFR的siRNA對SW480細胞的靶基因的mRNA抑制效率

5、39%，63%，48%；通過western blot檢查證實，這些siRNA對SW480細胞靶基因蛋白的表達抑制效果與realtime-PCR所檢查結(jié)果基本一致；②單基因沉默組和雙基因共沉默組均較對照組具有明顯抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480的增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用（P<0.05）；③雙基因共沉默組較單基因沉默組具有明顯抑制SW480細胞增殖的作用(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48小時后雙基因共沉默組轉(zhuǎn)染細胞的凋亡率為（20.1±1.7）%，高于單基

6、因沉默組Dc R3基因沉默凋亡率（16.5±2.2）%和EGFR基因沉默凋亡率（15.9±1.3）%(P<0.05)。
　　結(jié)論：①DcR3siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞后可有效抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480的DcR3mRNA和蛋白的表達，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染SW480后可有效抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480EGFR mRNA和蛋白的表達。②轉(zhuǎn)染DcR3siRNA和/或轉(zhuǎn)染EGFR s iRNA的人結(jié)腸癌細胞株SW480均表現(xiàn)出明顯的