利用Crispr-Cas9技術(shù)在CHO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中敲除DNMT3a基因及在CHO細(xì)胞中定點(diǎn)整合CTLA4Ig基因.pdf

1、背景和目的：
　　Crispr（Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats）稱為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列，最初發(fā)現(xiàn)于多種古生物與細(xì)菌基因組中，被認(rèn)為與其免疫系統(tǒng)相關(guān)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Crispr可用于基因工程，并將其開(kāi)發(fā)成為一種強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)。與早些年興起的基因編輯技術(shù)鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）相比，Cris

2、pr/Cas9系統(tǒng)操作更簡(jiǎn)單，所需時(shí)間少，編輯效率高且成本更低，因此近年來(lái)逐漸成為主流的基因編輯技術(shù)。在本文中，我們采用Crispr/Cas9系統(tǒng)在工程細(xì)胞株中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)中進(jìn)行靶向的基因編輯，并取得了成功。
　　目前市場(chǎng)上有一半以上的治療用重組蛋白藥物都是通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，但哺乳動(dòng)物細(xì)胞株存在不穩(wěn)定性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有的細(xì)胞株產(chǎn)量會(huì)顯著降低。研究表明這種不穩(wěn)定性有

3、可能和細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)，特別是DNA的甲基化。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)有三種控制DNA甲基化的酶，我們選擇了其中一種，即DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）進(jìn)行研究，通過(guò)Crispr/Cas9技術(shù)將控制此酶表達(dá)的基因敲除，并初步研究了該基因被敲除后細(xì)胞株的生長(zhǎng)特性及外源蛋白的表達(dá)情況。
　　另一方面，目前構(gòu)建重組細(xì)胞株的方法主要是隨機(jī)整合的方式，而這種隨機(jī)整合的細(xì)胞株由于無(wú)法控制目的基因在基因組中插入的位置，會(huì)造成稱之

4、為“位置效應(yīng)”的問(wèn)題，為克服此種情況的發(fā)生，學(xué)者紛紛轉(zhuǎn)向在基因組中定點(diǎn)整合目的基因。由于Crispr/Cas9技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有很多研究開(kāi)始嘗試?yán)闷溥M(jìn)行細(xì)胞基因組中目的基因的定點(diǎn)插入。在本文中，我們就利用Crispr技術(shù)在CHO細(xì)胞的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（FUT8）基因座中定點(diǎn)插入了細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4Ig）基因。
　　方法：
　　在CHO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中敲除DNMT3a基因：針對(duì)CHO細(xì)胞和HEK29

5、3T細(xì)胞DNMT3a蛋白的關(guān)鍵作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)短向?qū)NA（sgRNA），構(gòu)建成功后將兩對(duì)sgRNA共轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的細(xì)胞中，然后用有限稀釋法在96孔板中鋪單克隆并篩選到基因敲除的單克隆細(xì)胞株。用綠色熒光蛋白（GFP）作為模式蛋白來(lái)驗(yàn)證在DNMT3a基因敲除的細(xì)胞株中，外源蛋白的轉(zhuǎn)染及表達(dá)與野生型細(xì)胞是否具有差異。
　　在CHO細(xì)胞FUT8基因座中定點(diǎn)整合CTLA4Ig基因：在FUT8基因的起始密碼子ATG附近設(shè)計(jì)五對(duì)sgRNA，然后

6、挑選效率最高的兩對(duì)sgRNA，將其連同構(gòu)建的供體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，經(jīng)過(guò)加藥篩選后，用有限稀釋法鋪單克隆培養(yǎng)板，挑取單克隆并進(jìn)行檢測(cè)，成功得到CTLA4Ig基因定點(diǎn)整合的細(xì)胞株。
　　結(jié)果：
　　在CHO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中敲除DNMT3a基因：最終通過(guò)有限稀釋法篩選得到了一株DNMT3a基因完全敲除的CHO細(xì)胞株（后面簡(jiǎn)稱DNMT3a-CHO）和一株DNMT3a基因完全敲除的
　　HEK293T細(xì)胞株（后面

7、簡(jiǎn)稱DNMT3a-HEK293T）。應(yīng)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UMS）對(duì)細(xì)胞全基因組的胞嘧啶甲基化情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明相比于野生型CHO細(xì)胞（后面簡(jiǎn)稱
　　WT-CHO），DNMT3a-CHO細(xì)胞基因組甲基化胞嘧啶的含量降低了27％，而DNMT3a-HEK293T細(xì)胞基因組中甲基化的胞嘧啶含量要比野生型的HEK293T細(xì)胞（后面簡(jiǎn)稱WT-HEK293T）降低了22%。在生長(zhǎng)性質(zhì)方面，DNMT3a-CHO和WT-C

8、HO生長(zhǎng)特性無(wú)顯著差異，而DNMT3a-HEK293T較WT-HEK293T倍增時(shí)間延長(zhǎng)。應(yīng)用GFP作為模式蛋白驗(yàn)證在DNMT3a基因敲除的細(xì)胞株中，外源蛋白的產(chǎn)量是否得到了提高，結(jié)果表明在CHO細(xì)胞中，敲除DNMT3a基因?qū)FP的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響，而在HEK293T細(xì)胞中，敲除DNMT3a基因則會(huì)顯著減少GFP的單位表達(dá)量。
　　在CHO細(xì)胞FUT8基因座中定點(diǎn)整合CTLA4Ig基因：所設(shè)計(jì)的5條sgRNA編輯效率從17.7