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文檔簡介
1、第一部分、小鼠骨髓來源樹突狀細胞的改良培養(yǎng)
目的:運用改良方法,簡單、經(jīng)濟地從小鼠骨髓誘導(dǎo)和擴增得到大量高純度樹突狀細胞(DCs)。
方法:梯度密度離心法從小鼠骨髓分離得到單個核細胞,低密度接種骨髓單個核細胞于24孔板,加入含rmGM-CSF10 ng/ml和rmIL-45 ng/ml的RPMI1640全培養(yǎng)基培養(yǎng)6~8 d,LPS刺激成熟。光鏡、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)、流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞特異性表面標
2、志、單向混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)鑒定細胞刺激同種異體淋巴細胞的能力、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-12釋放水平。
結(jié)果:每只小鼠骨髓約可得到2×107個DCs,細胞呈典型的樹突狀突起,高表達特異性表面標志物CD11c(90.01%),高表達MHCⅡ類分子、CD86、CD80、CD40及CCR7,具有較強的促進T細胞增殖功能與釋放IL-12能力。
結(jié)論:方法改良后可簡單從小鼠骨髓獲得高
3、純度、具有功能的樹突狀細胞。
第二部分、CTLA4Ig修飾的樹突狀細胞體外對Th亞群分化的影響
目的:探討細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)修飾的樹突狀細胞(DC-CTLA4Ig)體外對Th亞群分化的影響。
方法:通過重組腺病毒載體將目的基因(CTLA4Ig)轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓來源的DCs。采用FCM檢測細胞表面分子和胞內(nèi)CTLA4Ig的表達;MLR檢測DCs刺激同種異體T細胞
4、的能力,ELISA法檢測抗原提呈反應(yīng)共培養(yǎng)體系中細胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的分泌水平,F(xiàn)CM檢測該共培養(yǎng)體系中Th1,Th2及Treg水平。
結(jié)果:CTLA4 Ig基因成功轉(zhuǎn)染至DCs,轉(zhuǎn)染率約為80%,制備的DC-CTLA4Ig穩(wěn)定表達CTLA4Ig,表面分子CD86呈現(xiàn)低表達;與對照組相比,DC-CTLA4Ig有效抑制T細胞增殖,降低共培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平,增加IL-10分泌,使IFN
5、-γ/IL-4比值亦有所上升;DC-CTLA4Ig雖使共培養(yǎng)體系中Th1及Th2水平同時降低,但Th1/Th2比值增加;DC-CTLA4Ig可上調(diào)Treg水平,并降低Th2/Treg比值。
結(jié)論:通過腺病毒將CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DCs并且高效表達,可有效降低DCs表面CD86分子,抑制同種異體T細胞反應(yīng),并能影響體外Th1/Th2和Th2/Treg水平。
第三部分、激發(fā)階段回輸DC-CTAL4Ig對哮喘小鼠
6、氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用
目的:研究建模激發(fā)階段回輸DC-CTLA4Ig對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的治療作用并觀察其可能機制。
方法:SPF級BALB/c小鼠90只,隨機分為正常對照組、哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組。哮喘模型組用OVA致敏和激發(fā);正常對照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替;DC-GFP對照組、DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組于首次激發(fā)前
7、30min分別回輸DC-GFP、DCs和DC-CTLA4Ig,余處理同模型組。觀察小鼠哮喘發(fā)作情況,肺組織病理切片檢測氣道炎癥,體描法檢測小鼠氣道高反應(yīng)性,檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)及分類,ELISA法檢測BALF和血清中細胞因子IFN-γ,IL-4和IL-10的水平,F(xiàn)CM檢測肺和脾臟Th1,Th2和Treg水平。
結(jié)果:與哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組小鼠比較,DC-CTLA4Ig激發(fā)期
8、尾靜脈回輸可明顯減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀;減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤;降低小鼠氣道高反應(yīng)性;降低氣道局部IL-4水平,增加IFN-γ和IL-10水平;降低肺部Th2比例,增加肺部Th1和Treg比例;但對血清中細胞因子水平和脾臟Th亞群無明顯調(diào)節(jié)作用。
結(jié)論:激發(fā)期尾靜脈回輸DC-CTLA4Ig可明顯減輕小鼠急性哮喘發(fā)作癥狀,減輕氣道炎癥,降低氣道高反應(yīng)性,而其可能機制與降低氣道局部Th2細胞因子分泌,增加氣道局部T
9、h1細胞因子分泌,糾正氣道局部Th1/Th2和Th2/Treg失衡有關(guān)。
第四部分、致敏階段回輸DC-CTAL4Ig對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用
目的:研究致敏階段回輸DC-CTLA4Ig對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的防治作用及其可能機制。
方法:SPF級BALB/c小鼠90只,隨機分為正常對照組、哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組。哮喘模型組
10、用OVA致敏和激發(fā);正常對照組用生理鹽水代替;DC-GFP對照組、DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組于0、14d致敏前30 min分別回輸DC-GFP、DCs和DC-CTLA4Ig,余處理同模型組。觀察小鼠哮喘發(fā)作情況,肺組織病理切片檢測氣道炎癥,體描法檢測小鼠氣道高反應(yīng)性,檢測BALF中白細胞總數(shù)及分類,ELISA法檢測BALF和血清中細胞因子IFN-γ,IL-4和IL-10的水平,F(xiàn)ACS檢測肺和脾臟Th1,Th2和Treg水
11、平。
結(jié)果:與哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組小鼠比較,致敏期尾靜脈回輸DC-CTLA4Ig可明顯減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀;減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤;降低小鼠氣道高反應(yīng)性;降低氣道局部IL-4水平,增加IFN-γ和IL-10水平;降低肺部Th2比例,增加肺部Th1和Treg比例;但對血清中細胞因子水平和脾臟Th亞群無明顯調(diào)節(jié)作用。
結(jié)論:致敏期尾靜脈回輸DC-CTLA4Ig可明顯減輕小鼠急
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