基于P48重組蛋白的牛支原體抗體檢測技術(shù)研究.pdf

1、牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）是感染牛的一種致病性病原體，主要引起牛乳腺炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎，也可引起角膜炎、結(jié)膜炎等疾病，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2008年，我國首次報(bào)道了M.bovis引起的犢牛傳染性肺炎，并造成了很大損失。目前，牛支原體感染已成為危害我國養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病之一。但我國迄今尚無特異、敏感的M.bovis抗體檢測試劑，缺乏有效的流行病學(xué)技術(shù)手段，這給牛支原體病的預(yù)防控制帶來了困

2、難。本研究利用牛支原體P48重組蛋白，建立了檢測M.bovis抗體的間接血凝試驗(yàn)方法和膠體金免疫層析試紙條，并完成了試劑盒組裝、實(shí)驗(yàn)室試制和質(zhì)量研究，為牛支原體病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效工具，對本病的預(yù)防控制具有重要意義。
　　本研究第一部分為M.bovis抗體的間接血凝試驗(yàn)方法和膠體金免疫層析試紙條檢測方法的建立。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化并合成牛支原體的p48基因，克隆到pET32a(+)表達(dá)載體上后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21

3、(DE3)，16℃低溫長時(shí)間誘導(dǎo)，獲得部分可溶性表達(dá)的P48重組蛋白。經(jīng)Western-blot檢測，純化的P48重組蛋白能與M.bovis高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。
　　以純化的P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞，建立了檢測牛支原體抗體的間接血凝試驗(yàn)方法(IHA)。P48重組蛋白致敏紅細(xì)胞的最佳濃度是20～40μg/mL，M.bovis高免血清抗體效價(jià)達(dá)1∶211。該方法對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性

4、腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清檢測均為陰性。分析特異性為100％，分析敏感性為93.33％。與國外商品化的ELISA試劑盒比較，平均符合率為96.15％。對833份田間血清和1084份乳清進(jìn)行檢測，陽性率分別是15.37％和19.56％。結(jié)果表明，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好，可用于牛支原體抗體水平檢測、牛支原體病的輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　利用合適粒徑的膠體

5、金顆粒在pH7.4條件下標(biāo)記6μg/mL P48重組蛋白作為金標(biāo)抗原包被金標(biāo)墊、山羊抗牛IgG(H+L)二抗包被檢測線（T線）、兔抗P48重組蛋白IgG多抗包被質(zhì)控線(C線)，組裝成膠體金免疫層析試紙條(ICS)。該試紙條檢測M.bovis高免血清，效價(jià)可至1∶106。檢測上述相近病原或者類癥病原陽性血清，不發(fā)生交叉反應(yīng)。與IHA方法相比，陽性符合率為93.57％，陰性符合率為93.02％，平均符合率為96.53％。檢測臨床血清200份