小鼠胚胎Pde4d的表達(dá)調(diào)控及其影響細(xì)胞增殖和遷移的研究.pdf

1、Pde4d基因位于小鼠13號(hào)染色體，該基因的編碼產(chǎn)物是磷酸二酯酶超家族（Phosphodiesterase， PDE）成員之一。因其專一性水解細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸（cAMP），可在cAMP/CREB和cAMP/EPAC細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮重要的作用。有研究指出，Pde4d是一個(gè)父本偏好的基因，并對(duì)遺傳疾病和腫瘤發(fā)生有重要的影響，但是此研究中的SNP位點(diǎn)不能準(zhǔn)確反映Pde4d的印記特點(diǎn)，且該基因與胚胎發(fā)育的關(guān)系并不十分清楚。因此，本文通過PCR

2、產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)Pde4d基因座在發(fā)育中的印記特點(diǎn)進(jìn)行分析；通過了解Pde4d在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式與調(diào)控特點(diǎn)，揭示其在胚胎發(fā)育中的潛在功能；并以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MS-K為研究模型，探討PDE4D對(duì)MS-K細(xì)胞增殖和遷移的影響，旨在揭示該基因可能在胚胎發(fā)育中具有的作用。
　　本研究為明確Pde4d在小鼠胚胎發(fā)育中的印記特點(diǎn)，首先利用生物信息學(xué)對(duì)Pde4d基因座進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，Pde4d印記報(bào)道中的SNP位于內(nèi)含子中的轉(zhuǎn)錄單元-

3、AK046832內(nèi)部，表明AK046832具有父本表達(dá)偏好的印記特點(diǎn)。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)，基因座內(nèi)部存在兩個(gè)CpG島（CGI1和CGI2）在發(fā)育過程中甲基化狀態(tài)發(fā)生了明顯改變，暗示CGI1和CGI2對(duì)Pde4d基因座的印記表達(dá)具有潛在的調(diào)控作用；其次，印記分析發(fā)現(xiàn)，Pde4d、AK046832和miR-1904具有不同的印記方式，Pde4d在E9.5天全胚胎及胎盤中具有父本偏好的表達(dá)特點(diǎn)，但在E15.5天的主要臟器及胎盤中呈現(xiàn)出雙等位表達(dá)，而

4、AK046832和miR-1904在發(fā)育過程中表現(xiàn)為雙等位表達(dá)。這些結(jié)果表明，Pde4d在胚胎發(fā)育過程中是一個(gè)印記模式動(dòng)態(tài)變化的基因。
　　由于Pde4d在小鼠胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)還不清楚，故本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）以及RNA原位雜交技術(shù)對(duì)該基因在胚胎和胎盤中的表達(dá)譜進(jìn)行分析。qRT-PCR結(jié)果顯示，在胚胎早期發(fā)育中，Pde4d的表達(dá)水平從2-細(xì)胞到桑椹胚階段呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而在囊胚中顯著降低；在中后期（E9.

5、5-E18.5）胚胎內(nèi)，該基因表達(dá)升高；Pde4d在胎盤中表達(dá)穩(wěn)定并且僅在發(fā)育后期表達(dá)上調(diào)。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)，Pde4d主要在中期（E9.5-E11.5）胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)以及體節(jié)中高表達(dá)，在器官形成階段（E12.5-E15.5），表達(dá)信號(hào)廣泛存在于除心臟外的主要臟器內(nèi)；在胎盤發(fā)育過程中，Pde4d的表達(dá)具有動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，在 E11.5天胎盤中，Pde4d明顯表達(dá)在成膠質(zhì)細(xì)胞層以及迷路層，在E12.5-E15.5天，Pde4d在迷路層的表

6、達(dá)信號(hào)減弱，而在成膠質(zhì)細(xì)胞層內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)。發(fā)育至 E16.5天，位于蛻膜層內(nèi) Pde4d的表達(dá)信號(hào)開始增強(qiáng)，隨著胎盤的進(jìn)一步發(fā)育，在E17.5-E18.5天胎盤的三層結(jié)構(gòu)中能明顯檢測(cè)到Pde4d的表達(dá)信號(hào)。以上結(jié)果顯示，Pde4d在胚胎和胎盤發(fā)育中是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化且廣泛表達(dá)的基因。
　　根據(jù) Pde4d基因座啟動(dòng)子和內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄單元的特點(diǎn)，本研究主要對(duì)DNA甲基化及內(nèi)含子miRNA的調(diào)控方式進(jìn)行分析。研究表明，Pde4d啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的Cp

7、G位點(diǎn)以組織特異性甲基化的方式影響E15.5天臟器內(nèi)Pde4d的表達(dá)水平；同時(shí)，在肝臟組織內(nèi)，啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的CpG位點(diǎn)以發(fā)育階段特異性甲基化的方式影響基因的表達(dá)。通過5-aza-cdR對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去甲基化處理，進(jìn)一步證明Pde4d啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的DNA甲基化與基因的表達(dá)水平相關(guān)；此外，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證，內(nèi)含子中的miR-1904能夠靶向其宿主基因Pde4d，在細(xì)胞中過表達(dá) miR-1904會(huì)抑制 Pde4d蛋白水平的

8、表達(dá)，故內(nèi)含子miR-1904能夠直接調(diào)控Pde4d的表達(dá)。因此，該結(jié)果表明基因啟動(dòng)子的甲基化及內(nèi)含子miR-1904是調(diào)控Pde4d表達(dá)的重要因素。
　　為進(jìn)一步解析Pde4d基因的功能，本研究分析了短亞型PDE4D1及長(zhǎng)亞型PDE4D7對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。研究結(jié)果表明，過表達(dá) PDE4D1和PDE4D7能顯著抑制MS-K細(xì)胞增殖及克隆形成，并引起細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞 G1期縮短，提前進(jìn)入 S

9、期；其次，兩個(gè)亞型均顯著降低MS-K細(xì)胞的遷移與鋪展能力，并且發(fā)現(xiàn)Vinculin基因表達(dá)上調(diào)，Integrinβ1基因表達(dá)下調(diào)；再次，兩個(gè)亞型引起了MS-K細(xì)胞與增殖和遷移相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)；最后，體內(nèi)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)表明，PDE4D7的過表達(dá)對(duì)MS-K細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。以上結(jié)果均表明，PDE4D1和PDE4D7在體內(nèi)和體外都能顯著抑制MS-K細(xì)胞的增殖和遷移能力。
　　綜上所述，Pde4d是一個(gè)在胚胎發(fā)育中印記模式動(dòng)態(tài)