小鼠細胞中外源piRNA對DHRS4基因和piRNA表達的調控.pdf

1、目的：全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是生物體內重要的生物活性物質，通過調節(jié)相應基因的轉錄參與細胞正常生長、增值、分化、凋亡，以及機體免疫調節(jié)、抗感染、抑制腫瘤細胞生長、增值等。有研究發(fā)現(xiàn)維甲酸水平高低可調控精子和卵子發(fā)生中的減數(shù)分裂過程。生殖細胞內必須保證一定維甲酸水平才能起始減數(shù)分裂。所以體內生理作用劑量的atRA受到嚴格的控制，其濃度的維持是由多種酶、多種蛋白因子參與的精細調節(jié)過程。atRA

2、的合成為維生素A（亦稱為視黃醇retinol）先氧化為視黃醛（retinal）再進一步氧化為RA。從Retinol到Retinal這一步為可逆反應，亦為atRA合成的限速步驟。輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶（ NADP(H)-dependent retinol dehydrogense/reductase,NRDR）在從視黃醇到視黃醛這一步中起著關鍵作用。編碼 NRDR的基因在人體具有三個拷貝，分別命名為DHRS4、DHRS4L2和DH

3、RS4L1，在黑猩猩、類人猿只存在兩個拷貝，而在其他很多哺乳動物體內只存在DHRS4單拷貝，比如鼠、豬、牛等。
　　piRNA(Piwi-interacting RNA)是從哺乳動物睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的一類能與PIWI蛋白相結合的小RNA，主要表達于不同物種的生殖細胞中，是繼小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）之后新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA。piRNA長度在26～31 nt左右，大部分集中在29～

4、30 nt，在5’具有明顯的尿嘧啶偏愛性(約86％)，且80%以上在基因組中有單一位點。piRNA的表達有明顯時序性，精子發(fā)育過程中進入減數(shù)分裂粗線期會產(chǎn)生PIWI蛋白，伴隨PIWI蛋白的生物發(fā)生會出現(xiàn)大量的piRNA，使得減數(shù)分裂順利進行。因此，piRNA被認為是生殖細胞減數(shù)分裂的重要事件之一。
　　生殖細胞發(fā)生減數(shù)分裂的另一個必要條件是細胞內要保持一定維甲酸（Retinoic Acid，RA）水平。那么體內對維甲酸起調控作用的

5、NRDR水平是否會受到piRNA大量出現(xiàn)的調控呢？為探討二者間的內在聯(lián)系，我們針對小鼠DHRS4基因的piRNA設計單鏈轉染序列，研究其piRNA的改變是否會調控DHRS4基因的表達，以致影響NRDR。此外也探討了外源性piRNA對內源性piRNA是否有調控作用。
　　方法：利用生物信息學方法查找 DHRS4基因上的piRNA位點，設計合成短單鏈piRNA，將其轉染小鼠睪丸畸胎瘤（P19）和小鼠睪丸間質細胞（TM4），24小時候后

6、收獲細胞，通過RNA提取，RT-PCR，real-time PCR，蛋白免疫印跡方法檢測小鼠DHRS4基因表達情況。此外通過轉染外源性piRNA，檢測內源性piRNA的表達情況。
　　結果：通過實驗發(fā)現(xiàn)位于DHRS4基因中第二內含子區(qū)域的2個piRNA中有一個促進DHRS4基因的表達。并且發(fā)現(xiàn)外源piRNA對內源piRNA的表達也有促進作用。
　　結論：piRNA對靶基因表達可能還有正向調控作用，豐富了piRNA的生物學功能