人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元樣細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)的體外分離、純化、擴(kuò)增和向膽堿能神經(jīng)元樣細(xì)胞的定向分化潛能，以期為BMMSCs的神經(jīng)移植提供理論依據(jù)。 方法: 應(yīng)用密度梯度離心法體外分離出BMMSCs，在含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)擴(kuò)增和傳代，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs的表面標(biāo)志。利用擴(kuò)增后的第二代BMMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞先用含40mg/L WHI-P131的完全培養(yǎng)基預(yù)

2、處理48小時(shí)后，在含10ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的完全培養(yǎng)基中預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)，最后以含1 μmol/L全反式維甲酸(ATRA)和10ng/ml音速波狀蛋白(Shh)的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)5小時(shí)；對(duì)照組不加任何誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)過(guò)程中在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，然后進(jìn)行神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)等神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，并分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率

3、。 結(jié)果: 分離擴(kuò)增后的BMMSCs強(qiáng)表達(dá)CD29;較強(qiáng)表達(dá)CD44、CD166和CD105；不表達(dá)CD45、CD34和HLA-DR。實(shí)驗(yàn)組BMMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后均能分化為具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞，并表達(dá)NSE(61.00±3.63)％、GFAP(14.42±2.74)％；且相當(dāng)部分神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)ChAT(9.92±1.29)％。對(duì)照組BMMSCs細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，且上述特異性標(biāo)志物表達(dá)均為陰性。 結(jié)論: BMMSCs