脂多糖(LPS)誘導(dǎo)綿羊肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建、EST分析和免疫相關(guān)基因的研究.pdf

1、脂多糖（lipopolysaccharide LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁外膜中的一種生物活性成分，在革蘭氏陰性細(xì)菌感染的發(fā)病機(jī)制中起十分重要的作用，能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而且作用于抗原提呈細(xì)胞，參與誘導(dǎo)抗感染的特異性免疫應(yīng)答，是早期免疫應(yīng)答反應(yīng)的最強(qiáng)刺激劑。本項(xiàng)研究旨在構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的綿羊肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫，為綿羊免疫相關(guān)功能基因研究提供基礎(chǔ)平臺；監(jiān)測免疫相關(guān)因子（細(xì)胞因子、TLR受體和防御素）基因?qū)PS刺激的應(yīng)

2、答反應(yīng)規(guī)律，探討其參與機(jī)體抗感染免疫的分子機(jī)制；通過基因工程表達(dá)相關(guān)功能基因并鑒定其生物學(xué)功能，為開發(fā)免疫佐劑和治療性藥物奠定基礎(chǔ)。 目前，綿羊各種組織類型的cDNA文庫數(shù)量還很少，可為綿羊基因組研究提供的遺傳標(biāo)記很有限，導(dǎo)致綿羊基因組物理圖譜研究較其它家畜如牛、豬等研究相對滯后。綿羊功能基因的研究主要集中在經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因，對抗感染免疫相關(guān)的因子研究很不充分，綿羊細(xì)胞因子、toll樣受體和防御素的表達(dá)分布、與病原感染之間的關(guān)系

3、以及自身之間相互調(diào)節(jié)的聯(lián)系都還不清楚，其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制對研究疾病的病理過程具有重要意義，有必要進(jìn)行深入的研究和探討。 本研究通過氣管灌流法從綿羊肺臟分離培養(yǎng)原代肺泡巨噬細(xì)胞，利用臺盼藍(lán)拒染試驗(yàn)和雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和鑒定，運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的綿羊肺泡巨噬細(xì)胞全長cDNA文庫，隨機(jī)挑選255個(gè)克隆進(jìn)行序列測定，通過BLAST/n/x對序列進(jìn)行比對分析，利用Sequin軟件提交新發(fā)現(xiàn)EST或基因；應(yīng)用

4、PCR和RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增綿羊細(xì)胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）、TLR受體家族、防御素sBD1和內(nèi)標(biāo)（G3PDH，α-Tubulin）基因，對其進(jìn)行克隆和序列分析，以含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒為模板建立熒光定量PCR檢測方法，動態(tài)監(jiān)測LPS誘導(dǎo)綿羊肺泡巨噬細(xì)胞過程中細(xì)胞因子、toll樣受體和防御素的應(yīng)答反應(yīng)規(guī)律；應(yīng)用RT-PCR和熒光定量PCR方法檢測綿羊防御素sBD1在綿羊不同發(fā)育階段的表達(dá)分布及表達(dá)差異。建立沙門

5、氏菌感染綿羊消化道模型，檢測防御素sBD1和IL-8對沙門氏菌感染的應(yīng)答反應(yīng)，對其抗感染生物學(xué)功能進(jìn)行研究；構(gòu)建重組綿羊GM-CSF表達(dá)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，通過甲醇誘導(dǎo)綿羊GM-CSF分泌表達(dá)。構(gòu)建原核表達(dá)載體在大腸桿菌中融合表達(dá)綿羊防御素sBD1，并對其進(jìn)行抗菌活性檢測。初步獲得以下結(jié)果： （1）構(gòu)建了脂多糖LPS誘導(dǎo)的綿羊肺泡巨噬細(xì)胞全長cDNA文庫，其庫容量達(dá)到1.3×106，重組率為95.7％，符合cDNA文庫建庫標(biāo)準(zhǔn)

6、；從255個(gè)隨機(jī)克隆中發(fā)現(xiàn)新EST或基因45個(gè)并提交GenBank，獲得登錄號EU366470-EU366473，EU366475-EU366492，EU366494-EU366497，EU370534-EU370552，未知基因6個(gè)； （2）系統(tǒng)地闡明了在LPS刺激0～48h過程中，綿羊細(xì)胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）、toll樣受體家族和防御素的應(yīng)答規(guī)律，即IL-1β在LPS刺激后6h達(dá)到最高值，I

7、L-8，GM-CSF在誘導(dǎo)后4-12h表達(dá)水平最高，IFN-γmRNA水平高峰期在16h以后。toll樣受體1、2、4、6、7、8、9、10均在肺泡巨噬細(xì)胞有表達(dá)，而toll樣受體3、5則未見表達(dá)，TLR2、4在誘導(dǎo)后20min就達(dá)到高峰，且在整個(gè)誘導(dǎo)過程中維持較高水平； （3）防御素sBD1在綿羊肺泡巨噬細(xì)胞中沒有表達(dá)，其主要在呼吸道和消化道組織中表達(dá)，而且是持續(xù)表達(dá)的，其在不同發(fā)育階段消化道表達(dá)水平高低為羔羊>成年羊>胎羊。

8、在感染沙門氏菌實(shí)驗(yàn)中IL-8明顯升高，而防御素sBD1表達(dá)反而有所降低； （4）在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)綿羊GM-CSF，其表達(dá)量占總蛋白17％；在大腸桿菌中融合表達(dá)了綿羊防御素sBD1，但未表現(xiàn)出抗菌活性。 以上結(jié)果表明，本研究成功地構(gòu)建了脂多糖LPS誘導(dǎo)的綿羊肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫，該文庫為國內(nèi)首個(gè)綿羊肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫，從對文庫克隆的序列分析來看，新的EST和未知功能的基因約占20％，豐富了綿羊基因組物理圖譜的

9、遺傳標(biāo)記。另外，該文庫是革蘭氏陰性菌主要抗原組分脂多糖刺激巨噬細(xì)胞cDNA文庫，為免疫相關(guān)的功能基因研究提供了平臺；綿羊幾種主要細(xì)胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）對脂多糖LPS刺激表現(xiàn)出時(shí)間和表達(dá)量的差異為闡明疾病病理狀態(tài)的分子機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，toll樣受體3、5和防御素sBD1在脂多糖刺激肺泡巨噬細(xì)胞中并不表達(dá)，說明肺泡巨噬細(xì)胞可能并不是其表達(dá)部位，toll樣受體2、4對脂多糖LPS刺激的敏感性很高，說明它

10、們參與早期的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在革蘭氏陰性菌感染中發(fā)揮重要作用；防御素sBD1在粘膜系統(tǒng)中廣泛分布，并且持續(xù)表達(dá)，表明其在粘膜天然免疫中一定發(fā)揮著重要作用，但其對沙門氏菌感染沒有反應(yīng)，可能是由于其并不直接參與抵抗細(xì)菌感染，而與其它類型病原感染有關(guān)，而IL-8明顯參與了消化道對沙門氏菌的抗感染免疫；綿羊GM-CSF參與早期的免疫應(yīng)答，并且在疫苗佐劑和治療性藥物表現(xiàn)出良好應(yīng)用前景，本研究在酵母中表達(dá)綿羊GM-CSF為進(jìn)行開發(fā)和應(yīng)用提供材料；防御