通心絡(luò)抑制TNF-α誘導的小鼠巨噬細胞增殖與遷移.pdf

1、目的:腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)是一種具備多種生物學功能的強效細胞因子，主要由單核細胞、巨噬細胞、T細胞、自然殺傷(NK)細胞等免疫細胞產(chǎn)生。作為免疫和炎癥反應的重要介質(zhì)，TNF-α可以誘生其它細胞因子，誘導細胞的抗病毒活性，刺激血管形成以及成纖維細胞有絲分裂等。在生理狀態(tài)下，它具有抗腫瘤、抗感染和促進組織修復等重要作用，對機體有利;一旦持續(xù)釋放，則會引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，造成機體發(fā)熱、休克、

2、惡病質(zhì)和組織損傷。因此，抑制TNF-α介導的炎癥反應，是治療多種疾病的一個重要環(huán)節(jié)。
　　通心絡(luò)(TXL)含有水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、土鱉蟲等蟲類藥物和人參、赤芍等植物藥物成分。研究證明，通心絡(luò)具有改善血管內(nèi)皮功能、舒張血管、溶栓、抗凝、調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定斑塊、抗炎、抗氧化等功能。臨床研究表明，通心絡(luò)可以降低心絞痛患者體內(nèi)C反應蛋白水平，同時能夠抑制炎性因子產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)能夠抑制IL-1β介導的冠狀動脈血管壁的炎性反應，緩解內(nèi)

3、膜增生及減輕血管狹窄，其作用可能是通過下調(diào)炎性因子及黏附因子表達來實現(xiàn)的。巨噬細胞增殖及向血管壁遷移在血管炎性反應和內(nèi)膜增生中發(fā)揮重要作用，然而，目前對TXL是否影響巨噬細胞的增殖和遷移尚不十分清楚，本研究探討TNF-α對巨噬細胞增殖和遷移的影響，觀察TXL是否可以抑制TNF-α誘導的小鼠巨噬細胞的炎癥反應。
　　方法:Real-time PCR和Western blot分析檢測TNF-α對小鼠巨噬細胞RAW264.7 cycli

4、n D1、cyclin E1和mmp-2等基因表達的影響;傷口愈合實驗檢測RAW264.7細胞遷移能力。動物實驗:實驗動物分為對照和給藥組，兩組動物分別用水和TXL灌胃7天后，尾靜脈注射TNF-α誘導炎癥反應，取血檢測血常規(guī)和C反應蛋白;取小鼠骨髓巨噬細胞檢測cyclinD1、cyclin E1和mmp-2基因表達。
　　結(jié)果:
　　1.TNF-α誘導RAW264.7細胞cyclin D1和cyclin E1表達Wester

5、n blot分析結(jié)果顯示，分別用0、1、10、100 ng/ml TNF-α刺激RAW264.7細胞24 h后，與對照組相比，cyclin D1和cyclin E1蛋白表達明顯升高。
　　用10 ng/ml TNF-α分別刺激RAW264.7細胞0、6、12、24 h后，cyclinD1和cyclin E1蛋白表達隨刺激時間延長而逐漸上調(diào)。以上結(jié)果表明，TNF-α可劑量和時間依賴性的誘導增殖相關(guān)基因表達。
　　Real-ti

6、me PCR結(jié)果也顯示，與對照組相比，TNF-α刺激使cyclin D1和cyclin E1 mRNA水平呈時間和劑量依賴性增加。這些結(jié)果表明，TNF-α通過誘導cyclin D1和cyclin E1表達促進RAW264.7細胞增殖。
　　2.通心絡(luò)抑制TNF-α誘導的RAW264.7細胞增殖用通心絡(luò)(TXL)預孵育RAW264.7細胞24 h后，再給予TNF-α刺激24 h，檢測cyclin D1和cyclin E1蛋白水平。W

7、estern blot結(jié)果顯示，TXL預處理組較單純TNF-α刺激組，cyclin D1和cyclin E1蛋白表達下調(diào)。Real-time PCR分析結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，TXL抑制TNF-α誘導的cyclin D1和cyclin E1表達。
　　3.TNF-α誘導RAW264.7細胞mmp-2表達用不同濃度的TNF-α（0、1、10、100 ng/ml）分別刺激RAW264.7細胞24 h后，進

8、行Western blot分析。結(jié)果顯示，隨著TNF-α濃度增加，遷移相關(guān)基因mmp-2的表達水平呈劑量依賴性升高。用10 ng/ml TNF-α刺激RAW264.7細胞0、6、12、24 h后，隨刺激時間延長，mmp-2表達呈時間依賴性增加。Real-time PCR分析結(jié)果與Western blot分析結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，TNF-α通過誘導mmp-2表達促進RAW264.7細胞遷移。
　　4.通心絡(luò)抑制TNF-α誘導的RA

9、W264.7細胞遷移用TXL預孵育RAW264.7細胞24 h后，再給予TNF-α刺激24 h，觀察mmp-2表達水平。Western blot結(jié)果顯示，TXL預處理組較單純TNF-α刺激組，mmp-2表達水平下調(diào)。Real-time PCR分析結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。
　　傷口愈合實驗結(jié)果顯示，用TXL預孵育RAW264.7細胞24 h后，再用10 ng/ml TNF-α刺激24 h，檢查細胞遷移情況。HE染色結(jié)

10、果顯示，TXL可以抑制TNF-α誘導的RAW264.7細胞遷移。
　　上述結(jié)果顯示，TXL通過抑制mmp-2表達而抑制TNF-α誘導的RAW264.7細胞遷移。
　　5通心絡(luò)抑制TNF-α誘導的炎癥反應小鼠分為對照和給藥兩組，分別用水和TXL灌胃7天后，尾靜脈注射TNF-α0.1 mg/kg。檢查結(jié)果顯示，對照組小鼠體溫、C反應蛋白、白細胞、中性粒細胞水平均明顯升高。與對照組相比，給藥組小鼠體溫、C反應蛋白、白細胞、中性粒細

11、胞均顯著下降，骨髓巨噬細胞中cyclin D1、cyclin E1和mmp-2 mRNA水平降低。以上結(jié)果表明，TXL通過抑制cyclinD1、cyclin E1和mmp-2表達，抑制TNF-α誘導的小鼠機體內(nèi)炎性反應。
　　結(jié)論:
　　1..TNF-α促進RAW264.7細胞增殖相關(guān)基因cyclin D1和cyclin E1表達。
　　2.通心絡(luò)通過下調(diào)cyclin D1和cyclin E1表達，抑制TNF-α誘導的