凡納濱對(duì)蝦過(guò)敏原活性評(píng)價(jià)及其抗原決定簇的初步表征.pdf

1、隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和國(guó)際食品貿(mào)易的日益擴(kuò)大，食物過(guò)敏問(wèn)題日益嚴(yán)重。為了更好的預(yù)防和控制食物過(guò)敏的發(fā)生，有關(guān)過(guò)敏原的評(píng)價(jià)和相關(guān)的機(jī)理研究成為急需解決的問(wèn)題。目前FAO/WHO頒布的食品過(guò)敏原樹(shù)狀評(píng)估體系還有待完善，尤其是動(dòng)物模型評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)，現(xiàn)在還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型和統(tǒng)一的評(píng)價(jià)方法。本文以蝦過(guò)敏原(八大類(lèi)容易引起過(guò)敏的食物之一)為代表建立系統(tǒng)的過(guò)敏模型，旨在構(gòu)建接近人體過(guò)敏情形、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的動(dòng)物評(píng)價(jià)模型，并對(duì)現(xiàn)有評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)展和完善。為

2、了從機(jī)理上探討過(guò)敏的機(jī)理，本論文還結(jié)合生物信息學(xué)手段對(duì)蝦過(guò)敏原的抗原表位進(jìn)行研究，對(duì)表位的一些特征進(jìn)行了初步的表征。 1、通過(guò)系統(tǒng)暴露方式建立了BALB/c小鼠致敏模型。結(jié)果表明，皮下注射是較優(yōu)的致敏方案可使小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度，被動(dòng)皮膚致敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IgE效價(jià)可達(dá)到32，但是皮下注射、腹腔注射兩種系統(tǒng)暴露途徑均可導(dǎo)致BALB/c小鼠假陽(yáng)性的評(píng)價(jià)結(jié)果。這兩種系統(tǒng)暴露途徑造成小鼠產(chǎn)生假陽(yáng)性致敏率達(dá)10％～30％。 2．首次

3、采用持續(xù)單純口服蝦過(guò)敏原(Pen a1)的方法成功建立了蝦過(guò)敏的BALB/c小鼠模型。該模型對(duì)Pen a1有特異性免疫應(yīng)答，對(duì)非致敏蛋白PAP無(wú)免疫應(yīng)答，特異性良好，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，該模型在免疫應(yīng)答上表現(xiàn)靈敏，致敏率達(dá)到80％，抗原消耗量低，完全符合口服暴露途徑建立的動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)。 3．首次嘗試構(gòu)建具有過(guò)敏體質(zhì)的小鼠評(píng)價(jià)模型，結(jié)果表明，仔鼠的過(guò)敏體質(zhì)和親代鼠的致敏狀況無(wú)關(guān)，IgE抗體并沒(méi)有通過(guò)親代鼠而感染仔鼠；但是在胚胎后

4、期的抗原暴露會(huì)導(dǎo)致仔鼠產(chǎn)生過(guò)敏體質(zhì)，成功率約為40％。這種利用食物過(guò)敏原在母鼠妊娠期進(jìn)行干擾來(lái)刺激小鼠免疫系統(tǒng)的方法，可有效的使仔鼠的IgE抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖率、細(xì)胞因子水平較正常小鼠產(chǎn)生明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該類(lèi)小鼠成年后對(duì)過(guò)敏原的后天刺激有明顯的易感傾向。 4．首次利用BALB/c小鼠腹腔內(nèi)的肥大細(xì)胞初步建立了評(píng)價(jià)過(guò)敏原致敏活性的體外模型。通過(guò)模擬體內(nèi)的生理環(huán)境實(shí)施肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，肥大細(xì)胞在體外可實(shí)現(xiàn)特異性釋放

5、，釋放率與IgE抗體滴度之間存在一致性，Pen a1在10-100ng/m范圍內(nèi)肥大細(xì)胞可以呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性釋放。 5．運(yùn)用體外模擬胃腸液消化模型評(píng)價(jià)的Pen a1在胃腸液消化的過(guò)程中分解成了33kd、23kd、14kd的蛋白質(zhì)片段，這些酶解片段在消化液中可以穩(wěn)定存在達(dá)1小時(shí)以上且均有致敏活性。在反應(yīng)進(jìn)行到60分鐘時(shí)，胃液和腸液中的Pen a1的致敏活性?xún)H降到了45％和30％。 6．在國(guó)內(nèi)外首次利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)Pen

6、 a1的抗原表位，得到了9個(gè)可能的抗原決定簇位點(diǎn)，它們分別位于Pen a1的40-48、51-63、75-86、136-150、163-179、191-204、216-228、242-255、262-282的肽段上。實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用了多種預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)了Pen a1的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)表面特性，并對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，基本構(gòu)建了預(yù)測(cè)過(guò)敏原B細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)分析預(yù)測(cè)體系。 7．對(duì)預(yù)測(cè)所得的抗原表位進(jìn)行了合成與活性鑒定，鑒定的結(jié)果表明H

7、Y-1、HY-2、HY-4、HY-6、HY-8、HY-9共6條抗原肽具有過(guò)敏活性，預(yù)測(cè)成功率66.67％?？乖瓫Q定簇在Pen a1上暴露情況的檢測(cè)結(jié)果表明6條活性抗原肽在Pen a1表面均有分布，HY-4、HY-9的肽段上可能存在多個(gè)IgE結(jié)合位點(diǎn)并有部分表位可能隱藏。Pen a1上抗原表位均具有較強(qiáng)的抗微波的能力，其中HY-4、HY-9肽段上的表位抗微波能力最強(qiáng)，在微波達(dá)到10min時(shí)仍保持微弱的致敏活性，懷疑與其獨(dú)特的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，

8、這些表位的特性在一定程度上揭示了Pen a1抗加工的內(nèi)在機(jī)理。 綜上所述，通過(guò)系統(tǒng)暴露途徑建立的小鼠致敏模型無(wú)法絕對(duì)避免對(duì)蛋白質(zhì)的假陽(yáng)性致敏，建議建模時(shí)不使用佐劑且需多設(shè)置實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)以確保評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性但是該模型的優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建方法簡(jiǎn)單、構(gòu)建周期較短；口服暴露評(píng)價(jià)模型更接近人體致敏的途徑，同時(shí)有效地消除了系統(tǒng)暴露模型的假陽(yáng)性致敏的缺陷，不足之處是建模周期較長(zhǎng)；過(guò)敏體質(zhì)小鼠模型的優(yōu)點(diǎn)在于體質(zhì)特征上和過(guò)敏人群更加接近，從而使評(píng)