凡納濱對蝦過敏原活性評價及其抗原決定簇的初步表征.pdf

1、隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和國際食品貿(mào)易的日益擴大，食物過敏問題日益嚴重。為了更好的預防和控制食物過敏的發(fā)生，有關(guān)過敏原的評價和相關(guān)的機理研究成為急需解決的問題。目前FAO/WHO頒布的食品過敏原樹狀評估體系還有待完善，尤其是動物模型評價環(huán)節(jié)，現(xiàn)在還沒有標準的動物模型和統(tǒng)一的評價方法。本文以蝦過敏原(八大類容易引起過敏的食物之一)為代表建立系統(tǒng)的過敏模型，旨在構(gòu)建接近人體過敏情形、經(jīng)濟、實用的動物評價模型，并對現(xiàn)有評價系統(tǒng)進行發(fā)展和完善。為

2、了從機理上探討過敏的機理，本論文還結(jié)合生物信息學手段對蝦過敏原的抗原表位進行研究，對表位的一些特征進行了初步的表征。 1、通過系統(tǒng)暴露方式建立了BALB/c小鼠致敏模型。結(jié)果表明，皮下注射是較優(yōu)的致敏方案可使小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度，被動皮膚致敏實驗檢測IgE效價可達到32，但是皮下注射、腹腔注射兩種系統(tǒng)暴露途徑均可導致BALB/c小鼠假陽性的評價結(jié)果。這兩種系統(tǒng)暴露途徑造成小鼠產(chǎn)生假陽性致敏率達10％～30％。 2．首次

3、采用持續(xù)單純口服蝦過敏原(Pen a1)的方法成功建立了蝦過敏的BALB/c小鼠模型。該模型對Pen a1有特異性免疫應答，對非致敏蛋白PAP無免疫應答，特異性良好，無假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，該模型在免疫應答上表現(xiàn)靈敏，致敏率達到80％，抗原消耗量低，完全符合口服暴露途徑建立的動物模型的標準。 3．首次嘗試構(gòu)建具有過敏體質(zhì)的小鼠評價模型，結(jié)果表明，仔鼠的過敏體質(zhì)和親代鼠的致敏狀況無關(guān)，IgE抗體并沒有通過親代鼠而感染仔鼠；但是在胚胎后

4、期的抗原暴露會導致仔鼠產(chǎn)生過敏體質(zhì)，成功率約為40％。這種利用食物過敏原在母鼠妊娠期進行干擾來刺激小鼠免疫系統(tǒng)的方法，可有效的使仔鼠的IgE抗體滴度、淋巴細胞增殖率、細胞因子水平較正常小鼠產(chǎn)生明顯的統(tǒng)計學差異，該類小鼠成年后對過敏原的后天刺激有明顯的易感傾向。 4．首次利用BALB/c小鼠腹腔內(nèi)的肥大細胞初步建立了評價過敏原致敏活性的體外模型。通過模擬體內(nèi)的生理環(huán)境實施肥大細胞脫顆粒實驗的結(jié)果表明，肥大細胞在體外可實現(xiàn)特異性釋放

5、，釋放率與IgE抗體滴度之間存在一致性，Pen a1在10-100ng/m范圍內(nèi)肥大細胞可以呈現(xiàn)劑量依賴性釋放。 5．運用體外模擬胃腸液消化模型評價的Pen a1在胃腸液消化的過程中分解成了33kd、23kd、14kd的蛋白質(zhì)片段，這些酶解片段在消化液中可以穩(wěn)定存在達1小時以上且均有致敏活性。在反應進行到60分鐘時，胃液和腸液中的Pen a1的致敏活性僅降到了45％和30％。 6．在國內(nèi)外首次利用生物信息學方法預測Pen

6、 a1的抗原表位，得到了9個可能的抗原決定簇位點，它們分別位于Pen a1的40-48、51-63、75-86、136-150、163-179、191-204、216-228、242-255、262-282的肽段上。實驗綜合運用了多種預測方法預測了Pen a1的二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)表面特性，并對多個指標進行綜合分析，基本構(gòu)建了預測過敏原B細胞結(jié)合位點的一個分析預測體系。 7．對預測所得的抗原表位進行了合成與活性鑒定，鑒定的結(jié)果表明H

7、Y-1、HY-2、HY-4、HY-6、HY-8、HY-9共6條抗原肽具有過敏活性，預測成功率66.67％。抗原決定簇在Pen a1上暴露情況的檢測結(jié)果表明6條活性抗原肽在Pen a1表面均有分布，HY-4、HY-9的肽段上可能存在多個IgE結(jié)合位點并有部分表位可能隱藏。Pen a1上抗原表位均具有較強的抗微波的能力，其中HY-4、HY-9肽段上的表位抗微波能力最強，在微波達到10min時仍保持微弱的致敏活性，懷疑與其獨特的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，

8、這些表位的特性在一定程度上揭示了Pen a1抗加工的內(nèi)在機理。 綜上所述，通過系統(tǒng)暴露途徑建立的小鼠致敏模型無法絕對避免對蛋白質(zhì)的假陽性致敏，建議建模時不使用佐劑且需多設置實驗樣本數(shù)以確保評價結(jié)果的準確性和可靠性但是該模型的優(yōu)點是構(gòu)建方法簡單、構(gòu)建周期較短；口服暴露評價模型更接近人體致敏的途徑，同時有效地消除了系統(tǒng)暴露模型的假陽性致敏的缺陷，不足之處是建模周期較長；過敏體質(zhì)小鼠模型的優(yōu)點在于體質(zhì)特征上和過敏人群更加接近，從而使評