與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白具有相似抗原決定簇的副溶血弧菌外膜蛋白的鑒定及其免疫學(xué)意義的研究.pdf

1、汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文題目：目：與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白具有相似抗原決定簇的副溶血弧與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白具有相似抗原決定簇的副溶血弧菌外膜蛋白的鑒定及其免疫學(xué)意義的研究菌外膜蛋白的鑒定及其免疫學(xué)意義的研究英文題目：英文題目：IdentificationimmunesignificanceoftheVibrioparahaemolyticusoutermembraneproteinwithsimilarantigenicdetermin

2、anttoLitopenaeusvannameihemocyanin姓名：名：楊冬學(xué)號(hào)：號(hào)：1110801110803636所在學(xué)院：所在學(xué)院：理學(xué)院理學(xué)院導(dǎo)師姓名：導(dǎo)師姓名：章躍陵章躍陵教授教授專(zhuān)業(yè)：業(yè)：海洋生物學(xué)海洋生物學(xué)入學(xué)日期：入學(xué)日期：20112011年9月答辯日期：答辯日期：20142014年1212月汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖過(guò)程中爆發(fā)的細(xì)菌性疾病給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為此，學(xué)者

3、們認(rèn)為深入揭示病原菌侵襲對(duì)蝦的分子機(jī)制是解決對(duì)蝦養(yǎng)殖疾病的有效途徑之一。有趣的是，課題組前期研究意外發(fā)現(xiàn)，兔抗蝦血藍(lán)蛋白抗體可與副溶血弧菌某些外膜蛋白發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)，但該外膜蛋白的性質(zhì)及其在侵染對(duì)蝦過(guò)程中的地位尚不清楚。為此，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、免疫學(xué)等策略對(duì)其進(jìn)行了較為深入的研究，所獲主要結(jié)果如下：首先，采用SDSPAGE、2DE、Westernblotting、MALDLTOFTOFMS等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

4、，發(fā)現(xiàn)與兔抗血藍(lán)蛋白抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的副溶血弧菌外膜蛋白為L(zhǎng)amB蛋白。繼而，采用分子生物學(xué)策略，對(duì)LamB蛋白進(jìn)行基因克隆與原核表達(dá)，成功獲得LamB重組子(pMD19TLamB和pET32a()LamB)及其原核表達(dá)蛋白（rLamB）。在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步運(yùn)用親和層析、Westernblotting和DotELISA等技術(shù)證實(shí)rLamB蛋白確實(shí)可以與兔抗蝦血藍(lán)蛋白抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果一致。尤其值得一提的是，抗原表位

5、預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LamB蛋白與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白可能存在11個(gè)相似的同源性抗原表位。由此推測(cè)，副溶血弧菌LamB蛋白應(yīng)該是一種與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白具有相似抗原決定簇的蛋白。最后，采用免疫共沉淀、LCESIMSMS等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LamB蛋白可能可與對(duì)蝦血漿中的β13葡聚糖結(jié)合蛋白(beta13glucanbindingprotein，LGBP)、β肌動(dòng)蛋白(betaactin)、Toll2、肌動(dòng)蛋白T2(actinT2)、烯醇酶(enolasepartial)

6、、精氨酸激酶(argininekinase，AK)和血藍(lán)蛋白(hemocyanin，HMC)等7種蛋白發(fā)生相互作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用RealtimePCR技術(shù)分析rLamB蛋白刺激對(duì)蝦后，其4種相互作用蛋白（β13葡聚糖結(jié)合蛋白、血藍(lán)蛋白、toll2和精氨酸激酶）在mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，該4種對(duì)蝦免疫因子表達(dá)量均出現(xiàn)“先下降后上升再下降”的模式，除精氨酸激酶12h下降最為明顯之外，其它3種免疫因子均在6h下降最為顯著。